猪氨肽酶N（porcine aminopeptidase N,pAPN）是一种锌金属蛋白酶，介导病毒与宿主细胞融合，是冠状病毒的细胞受体之一。为探究pAPN对猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）复制的影响，本研究从小肠组织中扩增出pAPN基因全长，通过限制性内切酶同源位点克隆到慢病毒载体中，获得携带pAPN基因的慢病毒载体PLVX-pAPN-mCMV-ZsGreen1-puro,在293T细胞中包装形成表达pAPN的慢病毒，将慢病毒感染Vero细胞，用嘌呤霉素加压筛选阳性细胞，采用有限稀释法筛选出稳定表达的Vero-pAPN细胞系，并通过测定N基因mRNA转录水平、N蛋白表达水平和TCID₅₀水平差异情况来验证该细胞系对PEDV复制的影响。结果显示，本研究构建的慢病毒能够感染Vero细胞，亚克隆筛选到的单克隆细胞株Vero-pAPN（2C5）能够稳定过表达pAPN;该细胞系能够促进PEDV复制，在12～48 h内N基因mRNA转录水平差异显著（P<0.05）、N蛋白表达水平均提高，TCID₅₀在24和48 h差异显著（P<0.05）。本研究构建了Vero-pAPN细胞系，pAPN在Vero细胞中过表达能够促进PEDV复制，该细胞系可作为疫苗高效生产和临床样本分离的候选细胞系。

旨在建立一种检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的重组酶介导等温核酸扩增(recombinase aided amplification,RAA)技术方法。基于对PEDV基因组的分析,筛选M基因的特异性序列作为检测靶标,设计扩增效率高、特异性好的RAA引物对和探针,通过荧光恒温检测仪实时监控扩增过程,结合免核酸提取技术,实现对PEDV核酸的快速、敏感和特异检测。结果表明,该方法具有较好的敏感性,最低检测限为8.86×10～1拷贝/μL;同时,该检测方法具有良好的特异性和重复性,不与猪传染性胃肠炎病毒、猪冠状病毒、猪圆环病毒等发生交叉反应。在37～41℃的恒温条件下,扩增曲线明显,表明该方法具有良好的温度适应性。本研究成功建立了检测PEDV的荧光RAA技术方法,有望用于PEDV的现场快速检测。

禽传染性支气管炎(infectious bronchitis, IB)是由禽传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)引起鸡的一种急性、高度接触性传染病，IBV变异程度高，现有的免疫手段常无法达到良好的效果，严重影响国内养禽业的发展。通过对IBV的非特异性免疫、黏膜免疫以及特异性免疫等3个方面现阶段免疫应答分子机制的综述，以期为IBV免疫机制的研究提供理论参考。

运用生物信息技术分析FliC_EcN的结构和潜在的抗原表位；借助ClonExpress^?同源重组技术设计引物，缺失FliC_EcN高变区不同结构域，并克隆至pET-28a（+）表达载体中表达，经SDS-PAGE和Western blot鉴定鞭毛蛋白变体；采用鲎试剂显色法检测鞭毛蛋白变体中内毒素残留，并使用不同质量浓度的鞭毛蛋白变体刺激Caco-2细胞，通过检测IL-8的分泌水平来评估各鞭毛蛋白变体的生物学活性。生物信息分析结果显示，FliC_EcN高变区的多数结构域被预测为含有潜在的抗原表位；PCR结果显示，fliC_{△820～1 518}、fliC_△736～963、fliC_{△985～1 200}、fliC_△748～828、fliC_{△1 114～1 191}和fliC_{△1 225～1 311}分别约为1 095、1 566、1 578、1 713、1 716、1 707 bp; SDS-PAGE结果显示，经镍柱纯化处理和透析复性的鞭毛蛋白变体分别约为41.36、57.06、57.50、61.97、61.95、61.56 kDa; Western blot结果显示，6个鞭毛蛋白变体均能与抗His单克隆抗体和大肠杆菌H7抗原诊断血清发生特异性反应；TLR5活性检测结果显示，缺失不同结构域的鞭毛蛋白变体保留了其TLR5激动剂功能。结果表明，本试验成功构建了6种FliC_EcN缺失高变区不同结构域的鞭毛蛋白变体，且各鞭毛蛋白变体均保留了其TLR5激动剂功能，展现了良好的生物学特性，为进一步研究鞭毛蛋白在缺失不同结构域后的佐剂效应以及鞭毛蛋白抗体滴度对其佐剂效应影响提供了参考依据。

2022年12月至2023年12月期间，在全国采集2 560份拭子样品，利用PCR方法对猫博卡病毒(feline bocavirus, FBoV)进行检测并扩增其NS1及VP2基因编码序列；同时，利用生物信息学方法分析FBoV的遗传多样性。结果显示，FBoV的总阳性率为4.6%(119/2 560),共在8个省或直辖市的样品中检出FBoV,疾病呈区域性流行特点；基因遗传进化分析结果显示，FBoV以多种基因型存在，我国主要以FBoV-1型流行为主，本研究鉴定的15株FBoV-1型毒株、4株FBoV-2型毒株、1株FBoV-3型毒株与中国、美国、泰国、澳大利亚、葡萄牙所鉴定的毒株遗传距离较近；同源性分析结果显示，各测序毒株与参考毒株间NS1及VP2基因氨基酸同源性分别为60.40%～99.20%和67.20%～100%,各测序毒株之间NS1及VP2氨基酸同源性分别为60.60%～100%和67.80%～100%,结果表明，我国流行的FBoV毒株具有明显的遗传多样性。本研究为阐明我国FBoV的流行现状充实了资料，并为后续针对FBoV的诊断或防控提供了流行病学调查基础。

为预测草原革蜱在新疆地区的分布点和适生区情况及了解其实验室条件下生活周期史，本研究使用最大熵(maximum entropy modeling, MaxEnt)模型对草原革蜱在新疆地区的地理分布以及适应区进行预测，并使用刀切法(jackknife test)及环境变量响应曲线评估影响草原革蜱分布的环境因子。根据预测的地点随机采集革蜱样本，利用形态学特征及分子生物学相结合方法鉴定革蜱种类。以新西兰大白兔为唯一供血动物，在实验室自然光照条件下采用耳套饲养法进行人工饲养，观察记录该蜱的生活史周期及生物学特性。使用刀切法检验及SPSS分析结果显示，影响草原革蜱适生区分布的主要环境变量因子为平均温度(Bio1)、均气温日较差(Bio2)、温度季节性变化(Bio4)、最干旱月降水量(Bio14)、降水量变异系数(Bio15)、最冷季度降水量(Bio19)。主要环境变量因子响应曲线结果显示，草原革蜱在Bio1为15.58℃、Bio2为6.19℃、Bio4的变异系数为1 500、Bio14为20 mm、Bio15的变异系数为23.799、Bio19为69 mm时存在概率最大。适生区预测结果显示，新疆草原革蜱适生区为准噶尔盆地、天山山脉及山间谷地、阿尔泰山、吐鲁番盆地、以及天山山脉以南部分地区，占新疆总面积的50.99%。根据MaxEnt模型预测地区采集革蜱，通过形态学结合分子生物学方法鉴定为草原革蜱；幼蜱饱血期为5.31 d,蜕化期为8.19 d,蜕化率达到95.5%;若蜱饱血期为8.65 d,蜕化期为12.86 d,蜕化率达到98%;成蜱饱血期为6.75 d,饱血雌蜱产卵前期为5.86 d,饱血雌蜱产卵期为12.5 d;蜱卵经25.92 d孵化为幼蜱，孵化率达到90%;草原革蜱在实验室条件下完成一个生活史需62～10 d,平均需86.0 d。所构建的MaxEnt模型具有较高的预测精度和准确性，根据主要环境因子变量分析，降水量和温度是影响草原革蜱的主要环境因子。本试验研究为新疆优势蜱种-草原革蜱的危害评估、建立实验室人工饲养纯种蜱体系及当地蜱传疾病的综合防控奠定了基础。

冠状病毒是迄今已知的基因组最大的RNA病毒，其中猪冠状病毒是引起仔猪急剧腹泻的重要病原体，具有高度变异特性，防控难度较高，每年给我国养猪业带来严重的经济损失。对冠状病毒RNA合成机制的解析有助于了解冠状病毒的遗传变异规律和筛选抗病毒药物，目前研究较深入的主要是鼠冠状病毒(murine coronavirus, MHV)和2型人严重呼吸道综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)。为探究猪冠状病毒的复制机制，本研究以MHV和SARS-CoV-2等冠状病毒为参考，总结了其与猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus, SADS-CoV)等猪冠状病毒非编码区调控病毒复制的机制。重点分析5′非编码区(5′untranslated region, 5′UTR)的保守基序及二级结构在病毒复制中的作用、3′UTR的保守结构如何调控病毒复制、病毒非编码区与宿主蛋白的相互作用调控病毒复制以及病毒非编码区变异特征等内容，为针对该类靶点的抗病毒药物和高病毒滴度疫苗候选株的开发提供理论基础。

为实现同时检测bla_NDM、mcr-1和cfr 3种耐药基因的方法。通过构建质粒标准品、对引物及探针设计和优化反应体系及条件，成功建立bla_NDM、mcr-1和cfr三重荧光定量PCR检测方法。该方法能特异性地检出bla_NDM、mcr-1和cfr,而对其他耐药基因均不能检出；3个耐药基因标准曲线的相关系数（R²）均大于0.999,变异系数（Cv）均低于1%;质粒标准品最低检出限值均为10～2 copies/μL。使用建立的方法对800份细菌样本进行检测，结果显示，含耐药基因mcr-1样本32份、只含耐药基因bla_NDM样本40份、只含耐药基因cfr样本2份；同时含有耐药基因mcr-1和bla_NDM的样本8份，未检出同时携带3种耐药基因的细菌样本。以上结果证实，本研究建立的三重荧光定量PCR方法具有灵敏性高、特异性强及稳定性好的优点，适用于临床上快速检测bla_NDM、mcr-1和cfr 3种耐药基因，为细菌多重耐药基因的检测和控制提供技术支持。

基于核因子E2相关因子2（Nrf2）/谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）信号通路研究槲皮素抑制玉米赤霉烯酮（zearalenone, ZEN）诱导IPEC-J2猪小肠上皮细胞铁死亡的作用机制。体外培养IPEC-J2细胞，ZEN处理（25mg/L）的同时给予不同浓度槲皮素干预（10、20、40μmol/L）。生化法检测各组细胞培养液上清中乳酸脱氢酶（LDH）、总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）水平；荧光探针检测细胞中Fe²⁺、活性氧（ROS）和脂质过氧化水平；Western blot检测Nrf2、长链酯酰辅酶A合成酶4（ACSL4）和GPX4蛋白表达水平。将IPEC-J2细胞分为对照组、ZEN组、槲皮素组和ML385（Nrf2抑制剂）+槲皮素组，除对照组外其余各组均接受ZEN处理，并采用槲皮素和ML385进行干预，检测Nrf2/GPX4通路相关蛋白表达和铁死亡指标(LDH、Fe²⁺、MDA和GSH)变化。结果显示，与对照组比较，ZEN组细胞存活率、T-AOC及GSH、SOD水平、Nrf2和GPX4蛋白表达降低（P<0.05）,细胞LDH释放率、Fe²⁺及ROS、脂质过氧化、MDA水平及ACSL4蛋白表达升高（P<0.05）。与ZEN组比较，槲皮素组细胞存活率、细胞T-AOC、SOD及GSH水平、Nrf2和GPX4蛋白表达升高（P<0.05）,细胞LDH释放率、Fe²⁺及ROS、脂质过氧化、MDA水平及ACSL4蛋白表达降低（P<0.05）。与槲皮素组比较，ML385+槲皮素组细胞Nrf2及GPX4蛋白表达和GSH水平降低（P<0.05）,细胞LDH释放率、Fe²⁺及MDA水平升高（P<0.05）。综上，槲皮素能够抑制ZEN诱导的IPEC-J2细胞铁死亡，其作用机制可能与其激活Nrf2/GPX4信号通路有关。

从污水中分离出1株沙门菌裂解性噬菌体PJN025,测定其生物学特性和全基因组序列，并评估其在动物感染模型中的治疗潜力。透射电镜观测结果显示，其属于Caudoviricetes科。PJN025仅裂解鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌，潜伏期约10 min,暴发期80 min,暴发量约为132 PFU/细胞，表明噬菌体能够高效杀菌；噬菌体的稳定性良好，在30～70℃之间和pH3～12范围内保持稳定。全基因组测序显示，该噬菌体基因组全长为46 478 bp, G+C含量为45.9%,包含82个开放阅读框和1个tRNA,未检测到已知的毒力基因或耐药基因。使用足部注射的方式对大蜡螟幼虫进行鼠伤寒沙门菌的攻毒，48 h时细菌攻毒的阳性对照组的存活率是5%,使用1×10～8 PFU/mL的PJN025噬菌体后，预防组的疗效最好，存活率可提高至70%;使用腹腔注射的方式对SPF小鼠进行鼠伤寒沙门菌的攻毒，5 d时细菌攻毒的阳性对照组中的小鼠全部死亡，使用1×10～8 PFU/mL的PJN025噬菌体后，共感染组的疗效最好，存活率可提高至60%,表明噬菌体的使用能够提高受试动物的存活率。结果表明，噬菌体PJN025特异性强、裂解效率高、对酸碱耐受性较好、耐热性强，安全性和预防效果好，为后续噬菌体产品的研制提供了材料和实验基础。

收集免疫反应较强的中间宿主羊细粒棘球绦虫感染阳性血清，以健康血清为阴性对照，纯化该血清与靶标蛋白经免疫沉淀捕获和富集相应的抗原，获得靶标蛋白-抗体-目的蛋白复合物。联合质谱策略筛选与鉴定细粒棘球绦虫相关特异性抗原，利用在线预测软件对肽段覆盖率最高的蛋白进行生物信息学分析。结果显示，IP-MS鉴定得到133种细粒棘球绦虫相关蛋白，其中肽段覆盖率≥70%的有1种蛋白，为肌动蛋白；肽段覆盖率为30%～40%的有3种蛋白，分别为含Ton B结构域蛋白、NADH脱氢酶(泛醌)1 α亚复合物2、乳酸脱氢酶；肽段覆盖率为20%～30%的有6种蛋白，分别为剪接因子3b亚基5、肿瘤蛋白D52、表达的保守蛋白、NADH脱氢酶(泛醌)1α亚复合物7、肌苷-5′-单磷酸脱氢酶和醛酮还原酶家族1成员B4。生物信息学分析显示，肌动蛋白无信号肽，可能为非分泌型蛋白，亚细胞定位在细胞骨架，存在6个最佳潜在抗原表位，二级结构和三级结构一致以α螺旋和无规则卷曲为主。结果表明，免疫沉淀-质普联用技术是筛选和鉴定细粒棘球绦虫抗原的一种高通量、简便、快速有效的方法，可为筛选中间宿主羊血清诊断标识的特异分子及包虫病新型诊断技术的研发提供依据。

对NCBI文库公布的120条不同亚型禽流感病毒的M基因序列进行分析，筛选得到一处高保守片段并进行重组酶介导等温核酸扩增(recombinase-aided amplification, RAA)引物和crRNA的设计。待测样品先进行RAA核酸扩增，再将扩增产物转移至有规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/Cas13a检测体系中，通过监测该体系中荧光值的变化情况进行结果判定。使用梯度稀释(10～6～10～0拷贝/μL)的标准阳性质粒以及其他7种禽病病毒验证方法的灵敏度和特异性，并利用本试验所建方法和国标荧光RT-PCR方法对50份临床样品(21份阳性样品、29份阴性样品)进行检测以评价方法的检测性能。结果显示，本试验建立的检测方法灵敏度为10～2拷贝/μL,较普通RAA方法灵敏度提高了2个数量级；能特异性检出AIV,不与NDV、IBV、ILTV、IBDV、ALV、AMPV、AAV-1发生交叉反应；与国标荧光RT-PCR方法相比，该方法检测的特异性、准确性和一致性分别为100%、95.24%和98.00%。结果表明，本试验建立了检测AIV通用型的RAA-CRISPR/Cas13a快速诊断技术，其在37℃条件下60 min内即可完成检测，具有快速、灵敏、特异等优势，为AIV的现场快速检测提供了手段。

鸡球虫专门在鸡肠道黏膜上皮细胞内生长繁殖，危害鸡群健康。然而，传统的化学药物很难通过细胞屏障，并且易造成耐药虫株的出现以及兽药残留问题，给球虫病的防控带来巨大的挑战，因此，有必要开发新的抗球虫策略。纳米药物具有生物相容性好、易修饰且效率高等优势，提高细胞膜的穿透性的同时降低了药物的毒副作用，有望应用于球虫病防治。本文介绍了多种抗鸡球虫病的纳米药物，总结了其与传统制剂相比的优点，重点介绍纳米药物在治疗鸡球虫病中的应用，阐述目前纳米药物治疗鸡球虫病仍存在的问题，并对该领域面临的挑战和未来发展方向进行展望，以期为开发用于治疗鸡球虫病的纳米药物提供重要参考。

为调查化脓隐秘杆菌在奶山羊乳房炎中的分布及其生物学特性，本研究从陕西省关中地区9个奶山羊养殖场中采集67份患乳房炎的奶山羊乳汁样品，经细菌分离培养获得21株化脓隐秘杆菌。对21株分离菌进行8种毒力基因PCR扩增，使用微量肉汤稀释法检测21株分离菌对10种抗菌药物的敏感性，利用Illumina NovaSeq 6000二代测序技术对选取的9株分离菌进行基因组测序，最后将分离菌经乳导管接种小鼠后验证其致病性。毒力基因检测结果显示，21株分离菌中plo、cbpA、nanH、nanp、fimA、fimC、fimE基因的阳性率分别为100.0%、38.1%、52.6%、31.6%、61.9%、57.1%和52.4%,而fimG基因均未检出，该结果与二代测序基因组比对结果一致。药物敏感性试验结果显示，分离菌对克林霉素(CLI)、头孢噻呋(CEF)和万古霉素(VAN)的敏感率为100.0%,对青霉素(PEN)、红霉素(ERY)、磺胺异噁唑(SXT)、氟苯尼考(FFC)、四环素(TE)、庆大霉素(GEN)和恩诺沙星(ENR)的耐药率分别为76.2%、52.1%、52.4%、52.4%、47.6%、42.9%和33.3%,其中至少对3种抗菌药物耐药的菌株比例为71.4%(15/21);使用ResFinder对耐药基因比对分析发现，9株分离菌株基因组包含8种耐药基因，分别是介导氨基糖苷类抗生素耐药的ant(2'')-Ia和ant(3'')-Ia、介导氯霉素类抗生素耐药的cmlA1和cmx、介导大环内脂类抗生素的erm(X)和lnu(A)、介导磺胺类抗生素耐药的sul1和介导四环素类抗生素耐药的tet(W),其中除tet(W)、cmlA和erm(X)外，此前，国内化脓隐秘杆菌分离株中尚未见其他耐药基因的相关报道。动物致病性试验中，小鼠接种分离菌后24 h出现乳腺红肿、充血、腺体组织炎性细胞浸润等现象，表明分离菌对小鼠乳腺组织有致病力。本研究针对奶山羊乳房炎源化脓隐秘杆菌的生物学特性及致病性开展初步研究，丰富了其耐药性及基因组数据，为奶山羊规模化养殖过程中化脓隐秘杆菌病的防治提供了参考依据和用药指导。

为了鉴别临床上以繁殖障碍及流产为特征的病毒性疫病，本研究建立了同时检测猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和非洲猪瘟病毒（ASFV）的四重qPCR方法，根据NCBI基因库中4种病毒保守基因设计4对特异性引物和探针，对反应的退火温度、引物浓度和探针浓度进行优化，并检验该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示：该方法不能检测到除目的病原以外的其他病原；对PRV、PPV、PCV2和ASFV 4种病原的最低检测限均为10拷贝；组内和组间重复性试验显示不同批次试验间C_t值变异系数均小于3%,说明该方法具有高度特异性、敏感性和稳定性。以上试验结果证明，本研究建立了高效灵敏的四重qPCR方法，为临床上猪伪狂犬病毒病、猪圆环病毒病、猪细小病毒病和非洲猪瘟的防控提供技术参考。

建立一种基于逆转录-重组酶聚合酶等温扩增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification, RT-RAA)及CRISPR Cas13a技术检测猪A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)的快速检测方法。根据猪SVA保守基因序列设计8对RT-RAA引物，筛选最适扩增引物、最佳反应温度、最优RT-RAA反应体系。针对优化的RT-RAA体系设计并筛选最佳CRISPR-derived RNA(crRNA),构建最优RT-RAA-CRISPR反应体系。利用6种常见猪群病原核酸验证已建立方法特异性。用数字PCR标定的SVA cRNA标准品验证已建立方法敏感性。通过重复试验验证方法的稳定性。应用已建立的方法与临床样品进行符合检验。RT-RAA及CRISPR反应体系优化结果显示，RT-RAA反应温度为37℃,扩增效果最佳；从8条crRNA中筛选出crRNA 5检测信号最强。建立的RT-RAA-CRISPR Cas13a方法特异性好，与ASFV、PRRSV、PEDV、PCV2、CSFV、PRV等常见猪群疫病均无交叉反应；方法敏感性高，对SVA最低检测限为0.86 copy/μL;对3个稀释度标准品检测均能稳定产生荧光，重复性好；能够在50 min内完成临床样品检测，对临床检毕的6份阳性样品及58份阴性样品进行符合检测，结果表明检测结果一致，符合率100%。结果表明，本研究建立了一种高特异性、高敏感性的RT-RAA-CRISPR Cas13a检测方法，有望应用于SVA的现场快速检测。

旨在研究植物雌激素大豆黄酮(daidzein, DZ)对妊娠期小鼠乳腺发育的影响。选取36只孕鼠，随机分为对照组(CON组，腹腔注射无菌PBS)、大豆黄酮组(DZ组，腹腔注射DZ工作液)和雌激素组(E2组，腹腔注射E2工作液),连续处理1周。孕鼠正常分娩后，各组分别在哺乳期第1和10天(Lac-1、Lac-10)选取6只小鼠取血后处死，取所有乳腺组织进行如下试验：1)乳腺组织称重，计算乳腺指数；常规法制作乳腺组织切片，HE染色；2)ELISA法测定血液中雌二醇(E2)、催乳素(prolactin, PRL)、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor, IGF-1)的含量；3)Western blot及RT-qPCR法分析乳腺组织内周期蛋白(CyclinD1、CyclinD3)、细胞核增殖抗原蛋白(PCNA)及雌激素受体ER-α、ER-β蛋白与基因的表达。结果显示：DZ处理可显著提高小鼠乳腺中腺泡的面积比(P<0.05),降低脂肪组织的面积比，腺泡的增殖扩张增多；DZ处理可极显著提高血清中PRL含量(P<0.01),提高血清中IGF-1含量，降低血清E2含量；DZ处理可显著上调CyclinD1、CyclinD3及PCNA蛋白的表达(P<0.05),同时显著上调ER-β蛋白的表达(P<0.05),极显著上调ER-β基因的mRNA水平(P<0.01)。综上所述，DZ处理可能通过促进增殖蛋白和细胞周期蛋白的表达来促进细胞的增殖及分裂，促进妊娠期小鼠乳腺腺泡的增殖，增加乳腺质量，同时可提高母鼠血清中IGF-1、PRL含量，共同促进妊娠期乳腺的发育。

根据GenBank上已公布的鸭源多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）kmt1基因序列，设计PCR扩增引物，将扩增所得kmt1基因克隆至pMD19-T载体中，构建重组质粒标准品pMD19-T-kmt1,并经PCR和测序鉴定。以pMD19-T-kmt1质粒为模板，kmt1基因为靶基因，设计并合成重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）引物；根据横向流动试纸条（lateral flow dipstick, LFD）要求设计1条探针（Pm-P）,经反应条件优化，建立了检测Pm的RPA-LFD方法，并进行特异性、灵敏性试验，用所建方法对64份临床样品进行检测。结果显示：建立的Pm RPA-LFD方法在37℃15 min即可完成扩增反应；提取鸭源大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）、鸭源沙门菌（Salmonella enteriditis,SE）、鸭疫里默杆菌（Riemerella anatipestifer,RA）、葡萄球菌（Staphylococcus）、鹅细小病毒（goose parvovirus, GPV）、鸭瘟病毒（duck plague virus, DPV）、番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus, MDPV）的DNA作为模板，以质粒标准品pMD19-T-kmt1为阳性对照进行RPA-LFD,显示除阳性对照外其他均为阴性；将质粒标准品pMD19-T-kmt1进行10倍倍比稀释，以浓度为10～7～10⁰ 拷贝/μL的质粒标准品为模板，检测出敏感度为1.50×10～1拷贝/μL,比PCR方法高100倍。利用PCR、RPA和LAMP-LFD检测64份疑似RA临床样本，3者检出符合率为100%。结果表明，本试验建立的Pm RPA-LFD方法具有特异性强、检测速度快、敏感度高等特点，可应用于Pm的临床样本检测。

为构建表达鹅星状病毒基因2型(GoAstV-2)衣壳蛋白(Cap)的重组禽腺病毒4型(FAdV-4),本研究将GoAstV-2的Cap基因表达盒插入到含有FAdV-4感染性克隆p15A-cm-FAdV4-HNJZ中FAdV4基因组的1 966 bp自然缺失区，将获得的重组感染性克隆p15A-cm-FAdV4-HNJZ-Cap/GoAstV-2利用限制性内切酶线性化后转染鸡肝癌细胞系(chicken hepatoma cell line, LMH),拯救出表达Cap蛋白的重组病毒rFAdV4-Cap/GoAstV-2。将重组病毒在LMH细胞中连续传至第15代，提取重组病毒基因组DNA,用插入位点两侧的鉴定引物进行PCR和利用抗Cap蛋白多克隆抗体进行间接免疫荧光试验和Western blot对重组病毒进行鉴定，同时对重组病毒在LMH细胞中的复制动态进行了研究。结果显示，GoAstV-2的Cap基因能够稳定存在于重组病毒rFAdV4-Cap/GoAstV-2基因组中，而且获得稳定表达；重组病毒具有良好的体外复制能力。本研究所制备的重组病毒rFAdV4-Cap/GoAstV-2为研制防控鹅FAdV-4和GoAstV-2混合感染的新型高效二联灭活疫苗奠定了基础。

采集健康、酮病奶牛外周血液并分离出CD4⁺ T细胞，Western blot检测脂质合成相关蛋白脂肪酸合成酶（fatty acid synthase, FASN）、乙酰辅酶A羧化酶1（acetyl coenzyme A carboxylase 1,ACC1）、白细胞分化抗原36（cluster of differentiation 36,CD36）及钙库操纵性钙离子内流（store-operated calcium entry, SOCE）相关蛋白ORAIl、ORAI2、ORAI3、STIM1、STIM2表达；流式细胞术检测IL-17表达。从1日龄犊牛脾脏分离CD4⁺ T细胞用于体外培养，细胞处理分为阴性对照siRNA处理组（Ctrl组）、沉默CD36（siCD36）组、硬脂酸（stearic acid, SA）组、SA+siCD36组。使用75 pmol/L阴性对照siRNA转染Ctrl组和SA组细胞48 h,然后用200μmol/L SA刺激SA组细胞24 h;使用75 pmol/L CD36 siRNA转染siCD36组和SA+siCD36组细胞48 h,然后用200μmol/L SA刺激SA+siCD36组细胞24 h。Western blot检测FASN、ACC1、CD36、钙释放激活钙调节因子1（calucium release-activated calcium channel protein 1,CRCM1,也称ORAI1）,ORAI2、ORAI3、基质相互作用分子1（slromal interaction molecule 1,STIM1）、STIM2蛋白表达；流式细胞术检测IL-17表达。结果显示，与健康奶牛相比，酮病奶牛外周血CD4⁺ T细胞中IL-17表达显著升高（P<0.01）;并上调了FASN、CD36、STIM1（P<0.05）及ACC1、ORAI2、ORAI3、STIM2的蛋白水平（P<0.01）。体外试验结果显示，相比于Ctrl组，SA组上调了CD36、ACC1、ORAI3（P<0.05）以及FASN、STIM1的蛋白表达（P<0.01）,IL-17表达显著升高（P<0.05）;相比于SA组，SA+siCD36组下调了STIM1、ORAI1（P<0.05）及CD36、ACC1、FASN、ORAI2的蛋白表达（P<0.01）,IL-17表达降低（P<0.05）。结果表明，SA通过CD36促进酮病奶牛CD4⁺T细胞脂质合成并激活SOCE通道，促进IL-17表达。

用生物信息学软件将本实验室分离的Escherichia coli QML2206-1(E.coli QML2206-1)株与不同菌种的外膜蛋白A(OmpA)蛋白氨基酸序列进行同源性分析，并对OmpA蛋白进行理化性质分析、跨膜结构和信号肽预测、B细胞抗原表位预测、二级和三级结构预测；将OmpA基因片段与pET-32a载体连接，构建原核表达载体，在BL21(DE3)进行原核表达并优化表达条件后用镍柱亲和纯化系统进行纯化；将纯化后的重组蛋白与弗氏佐剂充分混匀后免疫小鼠，利用ELISA方法检测小鼠特异性IgG抗体水平及小鼠血清中细胞因子CD4、CD8、IL-4的表达水平，并通过小鼠攻毒保护试验评价其免疫保护效果。结果显示，OmpA蛋白为亲水性蛋白，无跨膜结构域，二级结构主要由无规则卷曲(47.98%)和α-螺旋(29.77%)构成，有12个能与B细胞产生的抗体结合的抗原表位。经原核表达成功获得相对分子质量约为55 kDa的重组蛋白OmpA,且在37℃、IPTG浓度0.000 4 mol/L诱导6 h的表达量最高。重组蛋白免疫小鼠后血清特异性IgG抗体效价最高可达1∶32 000;与对照组相比，免疫小鼠血清中CD4、CD8及IL-4的表达水平均有升高。用最小致死量(minimum lethal dose, MLD)、2倍最小致死量(2MLD)攻毒后小鼠存活率分别为80%、40%。结果表明，OmpA重组蛋白具有良好的抗原性和一定的免疫保护作用。该研究为下一步基于OmpA蛋白的牦牛适用性E.coli基因工程亚单位疫苗的研制提供了技术依据。

针对牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)的基质蛋白(M)和血凝素-神经氨酸酶(HN)基因进行密码子优化并构建重组穿梭质粒Dual-M+HN;使用杆状病毒表达系统制备BPIV3病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs),并采用Western blot、间接免疫荧光和电镜对其进行验证；将验证成功的VLPs与MF59佐剂和CpG-ODN免疫增强剂混合通过肌注方式免疫小鼠。通过检测小鼠血清特异性抗体、中和抗体和血凝抑制抗体来评估BPIV3 VLPs的免疫效果。结果显示，优化后的M和HN蛋白基因密码子适应指数(codon adaptation index, CAI)分别为0.96和0.95,CG含量分别达到54.1%和53.1%;构建的重组质粒转化至DH10Bac进行蓝白斑筛选，将验证正确的重组杆粒转染至Sf9细胞，获得杆状病毒pFastBac-M+HN,电镜下观察可见直径约180 nm的BPIV3 VLPs; IFA和Western blot试验均证明目的蛋白的成功表达并具有生物学活性；通过蛋白优化发现感染剂量MOI=5时蛋白表达量最高；将50μg VLPs与MF59佐剂和CpG-ODN混合后肌注方式免疫小鼠，结果显示VLPs免疫组在首免2周时抗体开始上升，在二免后21 d时达到最高，平均IgG抗体滴度为1∶40 228,中和抗体滴度平均为1∶298,血凝抑制抗体滴度为1∶549,达到灭活苗水平(P≥0.05),表明本试验制备的VLPs能诱导机体产生体液免疫反应。结果表明，本试验成功制备了能自组装表达BPIV3 HN和M蛋白的VLPs,并能诱导小鼠机体产生体液免疫反应，为后续BPIV3 VLPs疫苗研究奠定了基础。

登革病毒(dengue virus, DENV)引发的疾病严重威胁着人类的生命健康，我国尚无对应的有效疫苗，本研究拟制备出1种针对Ⅱ型DENV的重组亚单位候选疫苗。以Ⅱ型DENV EDⅢ基因为目的基因，构建重组真核表达质粒并转染至悬浮细胞中表达目的蛋白，筛选合适的免疫剂量来免疫小鼠，进行免疫原性分析。成功构建出DENV重组真核表达载体，转染至HEK-293F表达目的蛋白，大小约为15 kDa。以铝盐为佐剂与不同剂量的重组蛋白混合免疫小鼠，分析免疫原性，首次免疫后第35天时，3个蛋白免疫组小鼠血清中特异性抗体水平明显高于佐剂组和PBS组，10μg D2EDⅢ蛋白组和20μg D2EDⅢ蛋白组特异性抗体水平分别是5μg D2EDⅢ蛋白组的1.43和1.56倍，抗体分型偏向于IgG1,表明本研究制备的Ⅱ型DENV重组亚单位候选疫苗主要提高体液免疫应答，但3个蛋白免疫组之间IgG1抗体水平差异并不显著。综合免疫效果及疫苗成本，每只小鼠最佳目的蛋白免疫剂量确定为10μg。本研究制备了1种Ⅱ型DENV重组亚单位候选疫苗，为DENV的预防提供参考。

通过同源重组构建pHCLV-p54感染性克隆，将其转染至SK6细胞盲传拯救出重组病毒rHCLV-p54,并测定其在体外的遗传稳定性、生长曲线，同时免疫家兔评价其免疫效果。结果显示，E183L基因能够在重组病毒中稳定遗传，但是插入的外源基因影响C株的复制；家兔免疫试验结果显示，重组病毒rHCLV-p54能够诱导家兔产生抗ASFV的特异性抗体。结果表明，表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)p54蛋白的重组病毒rHCLV-p54具有良好的免疫原性，有望作为候选疫苗进一步评价。

本研究研发了一种基于重组酶介导核酸扩增(RAA)技术结合胶体金试纸条快速检测牛肠道病毒(BEV)的方法。以高度保守的BEV 5′UTR作为靶序列，设计出特异性引物，下游引物5′端标记生物素，探针5′端标记6-FAM,初步建立RT-RAA方法。将鼠源抗6-FAM单克隆抗体作为金标抗体，链霉亲和素包被于检测线，羊抗鼠IgG包被于质控线，组装试纸条。将RAA技术与制备的胶体金试纸条相结合，建立起检测牛肠道病毒的RT-RAA-LFD方法，并对该方法的特异性、敏感性与重复性及临床应用等方面进行了评价。结果显示，该方法最佳引物浓度为5μmol/L,在35℃反应8 min即可完成对BEV核酸的扩增；该方法最低检测限为10～1拷贝/μL,且与牛病毒性腹泻病毒、牛细小病毒、口蹄疫病毒均无交叉反应；制备的试纸条于4℃条件下，有效期至少为90 d; 74份临床样品检测结果显示，该方法与RT-PCR检测结果一致。上述结果表明，本研究建立的BEV RT-RAA-LFD方法灵敏度高、特异性强，且操作更加便捷，适用于临床现场检测，为BEV感染的诊断和流行病学调查提供了新的技术手段。

猪丁型冠状病毒(PDCoV)是近年来新发现的冠状病毒，可引起仔猪严重的腹泻、呕吐、脱水甚至死亡。S蛋白是PDCoV的重要结构蛋白，决定着病毒的宿主或组织嗜性，也是研制PDCoV疫苗和检测方法的重要靶点。为制备PDCoV S蛋白的单克隆抗体，本研究基于国内PDCoV流行毒株S蛋白胞外域序列，构建S蛋白重组质粒转化DH10Bac感受态细胞，经蓝白斑筛选及PCR鉴定重组Bacmid,通过昆虫-杆状病毒系统表达S蛋白。将获得的S蛋白免疫BALB/c小鼠，并以免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，通过间接ELISA方法和亚克隆筛选出稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞。免疫印迹和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定出5株(2E5、4D5、5D10、2F7和5A9)特异性识别S蛋白的杂交瘤细胞。中和试验表明，3株单克隆抗体(2E5、4D5和5D10)具有病毒中和作用。本研究成功表达了S蛋白及制备了5株能稳定分泌与PDCoV病毒和S蛋白特异性结合的单克隆抗体，为进一步研究S蛋白的结构与功能、PDCoV感染的检测方法开发、预防或治疗用制剂等研究奠定了重要基础。

基于昆虫杆状病毒表达系统和新城疫病毒样颗粒载体平台，采用间接免疫荧光、Western blot和透射电镜等方式，构建一种表面展示NDV HN蛋白、FAdV4 Fiber-2蛋白、FAdV-8a Fiber蛋白和FAdV-8b Fiber蛋白的二联三价嵌合型病毒样颗粒(ND-FAdV-4/8a/8b cVLPs)。结果显示，成功构建了表达FAdV-8a Fiber和FAdV-8b Fiber蛋白的重组杆状病毒rBV-c8aFiber和rBV-c8bFiber。此外，ND-FAdV-4/8a/8b cVLPs各组分蛋白均正确表达，是一种约100 nm、具备囊膜和纤突的纳米颗粒，为新城疫、禽腺病毒病的防控提供了一种安全的病毒样颗粒新型疫苗候选株。

应用F81细胞从临床症状表现为口腔黏膜溃疡、鼻腔黏膜潮红且分泌物增多的患病猫中分离出1株病毒，通过PCR鉴定测序、形态学、血清学和动物回归试验分析确定该病毒为猫杯状病毒，命名为FCV-BJ。同时，制备该病毒灭活疫苗，并对其安全性与有效性进行了确定。结果显示，该分离毒株FCV-BJ血清学和形态学符合杯状病毒特点，动物回归试验表明该毒株有较强毒力，感染猫呈现猫杯状病毒感染的临床症状。将不同滴度的第5代病毒细胞培养物以β-丙内酯作为灭活剂灭活后免疫家猫，并在加强免疫21 d后攻毒。攻毒14 d后以10^7.0TCID₅₀/mL及以上滴度免疫的家猫组未发病，而对照组猫全部发病。上述结果表明，FCV-BJ分离株灭活疫苗免疫原性较好，最小免疫剂量在10^7.0 TCID₅₀/mL并且具有较强的保护效力，可作为疫苗生产用候选毒株，为将来猫杯状病毒疫苗的研制提供新毒株参考和奠定基础。

猪肉的质量与猪骨骼肌的发育和肌内脂质沉积有关，而骨骼肌卫星细胞具有分化为成肌细胞、脂肪细胞的潜能。为分析骨骼肌卫星细胞的增殖分化对骨骼肌形成的影响，本研究从长白猪和巴马香猪背最长肌处分离纯化骨骼肌卫星细胞，并利用免疫荧光检测Pax7的表达情况进行细胞鉴定。通过RT-qPCR检测2个品种猪骨骼肌卫星细胞中细胞周期相关因子和成肌成脂相关因子的mRNA表达量，CCK-8检测2种细胞的增殖情况。结果表明，2个品种猪骨骼肌卫星细胞表现出不同的增殖能力和分化潜能：与巴马香猪相比，长白猪骨骼肌卫星细胞表现出较强的增殖能力和较高的成肌分化潜能以及较低的成脂分化潜能。本研究发现不同肉质猪骨骼肌卫星细胞增殖分化能力存在差异，为阐明不同肉质猪骨骼肌形成差异的相关机理提供了理论依据。

非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是一种猪的急性、热性、高度接触传染性出血性传染病，具有高度致死性，给养猪业造成巨大经济损失。ASF的实验室确诊目前多采用特异性核酸扩增技术，但该方法受多种因素影响，尤其是环境中核酸扩增产物的污染给扩增结果判定带来诸多困扰。为了对ASF临床样品进行高通量诊断检测，本研究以ASF阳性猪血清IgG为捕获抗体，HRP标记的p72单克隆抗体为检测抗体，以细胞培养的非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）绘制标准曲线，建立了双抗体夹心ELISA抗原检测方法，并评价了其敏感性、特异性和重复性，进一步比较了不同因素对抗原检测的影响。结果显示，本研究建立的夹心ELISA检测方法对重组蛋白和ASFV的最低检测限分别为0.1 mg/L和10^3.7 TCID₅₀/mL,与5种常见致病性猪源性病毒均不发生交叉反应，试验批间变异系数小于10%;与实时荧光定量PCR对临床血液病毒检测的总符合率为92%（23/25）。在对灭活ASFV抗原的检测中证明，BEI灭活会显著降低ASFV抗原检测的灵敏度，铝胶佐剂和纳米佐剂会干扰抗原的检出。综上，本研究建立的双抗体夹心ELISA抗原检测方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性，与qPCR法有良好的一致性，为ASFV临床诊断以及灭活ASFV抗原评价提供了一种高通量检测方法。

为探讨党参皂苷对H9N2亚型禽流感病毒（avian influenza virus, AIV）感染引起机体免疫抑制的调控作用，首先应用不同质量浓度（5、10、20 mg/L）党参皂苷孵育大鼠肺微血管内皮细胞（rat pulmonary microvascular endothelial cells, RPMECs）,采用RT-PCR和流式细胞术检测PD-L1表达水平变化，并以ELISA试剂盒检测上清液中TNF-α、IFN-γ、IL-10含量及空斑法检测上清液中H9N2 AIV的滴度。然后利用8μm孔径Transwell板建立RPMECs和T细胞共培养体系，以模仿循环T细胞跨过微血管迁移到病毒感染部位的过程。在Transwell上室中培养RPMECs,用H9N2 AIV接种RPMECs, 1 h后加入含20 mg/L党参皂苷的培养基，36 h后加入T细胞。作用8 h后，收集下室中的T细胞，用流式细胞仪检测CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的比例，用ELISA试剂盒检测上清液中IL-2、IFN-γ和Granzyme B的表达水平，流式细胞分选技术检测Perforin-1阳性T细胞的比例，MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测T细胞的增殖活性，Annexin V-FITC/PI对T细胞染色后用流式细胞仪检测凋亡细胞的百分比。结果显示，党参皂苷可显著降低H9N2 AIV感染诱导的RPMECs中PD-L1的表达水平、IL-10及TNF-α表达量，降低T细胞凋亡率，但可显著提高跨内皮迁移T细胞中IL-2、IFN-γ、Perforin-1和Granzyme B的表达量及T细胞的增殖活性。结果表明，党参皂苷可显著抑制RPMECs中H9N2 AIV诱导的PD-L1的表达，增强跨内皮细胞层迁移T细胞的抗病毒功能，有利于增强宿主对H9N2 AIV抵抗能力。

为了解当前湖南省猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus, PRV）流行及遗传变异情况，本研究于2021—2022年从湖南省部分地区采集18 861份血清样品和1 725份疑似感染PRV组织样品，分别采用ELISA法和qPCR检测血清样品PRV-gE抗体和组织样品PRV核酸，并统计不同年份和季节样品阳性率。同时，对15份PRV阳性样品gC基因序列进行PCR扩增、测序及序列分析，并将阳性病料接种于Vero细胞，初步探究分离株生物学特性。结果发现，2 004份血清和56份组织样品分别检测为PRV-gE抗体和PRV核酸阳性，阳性率分别为10.74%和3.25%。序列分析结果表明，15份PRV阳性样品的gC基因核苷酸和对应氨基酸序列相似性分别为98.4%～100.0%和98.8%～100.0%。遗传进化分析结果显示，13个阳性样品与已知PRV变异株同属于一个分支，而另外2个样品与已知PRV经典株聚为同一个分支。病毒分离获得1株PRV变异株，该毒株可引起Vero细胞出现典型病变，病毒最高滴度为10^8.2 TCID₅₀/mL。本研究揭示出PRV在湖南省各地区广泛流行，且流行基因型包括PRV变异株和经典株，其中变异株为优势流行亚型，为探究湖南省PRV分子流行病学特征及疫苗研发提供了科学依据。

为分析牛呼吸道多杀性巴氏杆菌的生物学特性及其在规模化牛场的流行情况，对内蒙古呼和浩特规模化牛场中患呼吸道疾病的病死牛的肺脏、肝脏样品进行细菌分离培养、形态学观察，通过生化试验、16S rRNA基因测序、特异性引物PCR鉴定、荚膜血清型分型、致病性试验、毒力基因检测、药敏试验和耐药基因检测方法对分离株进行研究。结果显示，从病死牛的肺脏中分离鉴定出6株荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌，细菌16S rRNA序列测序后比对发现6株多杀性巴氏杆菌与重庆分离株CQ2(CP033599.1)的亲缘关系最为接近。小鼠致病性试验及毒力基因检测结果显示，分离株均有致病性，并携带有exbB、nanB、sodC、oma87等至少16个及以上相关毒力基因，但均未检出hsf1和toxA。药敏试验及耐药基因检测结果显示，分离株对环丙沙星、氧氟沙星、头孢噻肟等抗菌药物有不同程度敏感，对链霉素、克林霉素和林可霉素耐药，检出strA、strB和tet(H)耐药基因。综上，结果表明牛A型多杀性巴氏杆菌的致病性与毒力基因，耐药表型与耐药基因具有一定相关性，临床上推荐使用喹诺酮类(环丙沙星等)和头孢类(头孢噻肟等)抗菌药物，可为牛场防治由多杀性巴氏杆菌引发的呼吸道疾病提供科学依据和防控方案，为牛呼吸道多杀性巴氏杆菌病的流行病学监测奠定基础。

对边缘革蜱(Dermacentor marginatus)水通道蛋白(aquaporin, AQP)rDmAQP1、rDmAQP2和rDmAQP3纯化后免疫家兔，采血，进行Western blot和ELISA试验，第3次免疫2周后进行抗蜱试验。利用SDS-PAGE凝胶电泳筛选出rDmAQP1、rDmAQP2和rDmAQP3的最优表达条件，经HisSep Ni-NTA 6FF纯化柱将3种重组蛋白纯化，家兔分4组，每组3只家兔，对照组1组，免疫组3组。纯化的3种重组蛋白分别单独免疫3组家兔，在0、14、21 d分别进行1次免疫，每隔7 d采血1次，制备多克隆抗体，Western blot检测其反应原性，用ELISA检测其抗体效价，待抗体效价升高后开展攻蜱试验。结果显示，rDmAQP1的最优表达条件是IPTG浓度为1.0 mmol/L、37℃诱导8 h; rDmAQP2的最优表达条件是IPTG浓度为1.0 mmol/L、37℃诱导7 h; rDmAQP3的最优表达条件是IPTG浓度为1.0 mmol/L、37℃条件下诱导5 h。Western blot结果显示rDmAQP1、rDmAQP2和rDmAQP3都具有一定的反应原性。ELISA结果显示rDmAQP1、rDmAQP2和rDmAQP3免疫家兔的抗体效价分别为：1∶409 600、1∶512 00和1∶409 600,rDmAQP1蛋白免疫后总的抗蜱效果为79.74%,对边缘革蜱的平均饱血蜱质量、平均卵质量及平均卵孵化率的抑制率分别为9.43%、25.17%和63.81%;rDmAQP2蛋白免疫后总的抗蜱效果为78.78%,对边缘革蜱的平均饱血蜱质量、平均卵质量及平均卵孵化率的抑制率分别为8.30%、20.14%和68.26%;rDmAQP3蛋白免疫后总的抗蜱效果为87.91%,对边缘革蜱的平均饱血蜱质量、平均卵质量及平均卵孵化率的抑制率分别为3.23%、22.47%和80.50%。本研究通过血清学试验及抗蜱试验，发现rDmAQP1、rDmAQP2和rDmAQP3都具有抗蜱疫苗候选抗原潜力，其中rDmAQP3的免疫效果最佳，为rDmAQP1、rDmAQP2和rDmAQP3功能研究奠定了基础。

为建立一种能鉴别鸡星状病毒(chicken astrovirus, CAstV)和禽肾炎病毒(avian nephritis virus, ANV)的二重荧光RT-LAMP,该研究对比GenBank中下载的CAstV ORF1b基因和ANV ORF1b基因保守序列，分别设计了2套特异性引物和标记荧光基团的探针。在CAstV探针3′端标记FAM荧光基团，5′端标记淬灭基团BHQ1;ANV探针3′端标记CY3荧光基团，5′端标记淬灭基团BHQ2,通过试验筛选出最适引物和探针浓度并进行反应条件的优化。用建立的二重荧光RT-LAMP进行特异性、敏感性、重复性和干扰性试验，并对采集自广西南宁不同地区的临床样品共300份进行检测，结果与RT-qPCR和RT-PCR比较，验证该方法的有效性。试验结果显示：建立的二重荧光RT-LAMP方法60 min即可反应结束，最适反应温度为65℃;设计的引物仅能检测CAstV和ANV,而对其他病源无交叉反应；CAstV最低检测限度为1.4×10～2 copies/μL,ANV最低检测限度为1.5×10～2 copies/μL,且干扰性试验和重复性试验良好；检测结果与RT-qPCR相比，CAstV和ANV检测结果符合率分别为97.97%和98.85%。综上所述，该研究建立的二重荧光RT-LAMP方法具有快速、准确、特异性好、灵敏性高、重复性好等特点，适用于临床诊断，为CAstV和ANV的流行病学调查提供技术支持。

表位疫苗是近年来快速发展的一种新型疫苗构建策略，具有安全性高、可诱导机体产生高效的特异性体液免疫和细胞免疫应答等优势。其中，抗原表位的鉴定和递送是设计表位疫苗的关键。相比传统的抗原表位鉴定方法，目前已发展了生物信息学、ELIspot以及细胞内细胞因子染色等多种新技术。由于用表位抗原肽直接免疫的效果通常不理想，因此为了使表位诱导良好的免疫应答，亟需有效的递送系统。目前，常用的抗原表位递送系统主要包括病毒载体和自组装纳米颗粒等非病毒载体两种。另外，为增强表位的免疫效果，常对抗原表位进行修饰，如多个抗原表位串联及靶向修饰等方法。本综述总结了精确鉴定具有良好免疫原性抗原表位的方法以及抗原表位的有效递送策略，以期为新型表位疫苗创制提供一定的理论指导。

基于网络药理学和分子对接探究芹黄素抗猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV)感染的作用。综合运用Pharmmapper、Pubchem等多个数据库获取芹黄素的作用靶点，通过检索PubMed数据库获取了TGEV感染的相关作用靶点，利用Draw Venn Diagram分析得到芹黄素-TGEV感染的共同靶点，通过STRING数据库分析蛋白质-蛋白质相互作用关系(PPI)并获取关键的核心靶点，采用DAVID数据库对共同靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析，最后，通过分子对接和体外细胞试验对分析结果进行验证。在筛选过程中，共获得了431个芹黄素的作用靶点，1 177个TGEV感染的相关靶点以及50个芹黄素-TGEV感染的共同靶点；GO富集分析结果显示，芹黄素主要调控细胞分化、细胞膜筏形成、凋亡过程及炎症反应的调节；KEGG富集分析获得了前15条在统计学上具有显著性差异的结果，涉及到PI3K-Akt和TNF信号通路等；分子对接的结果显示，芹黄素与基质金属蛋白酶3(MMP3)结合能最低(-9.5 kJ/mol),结合活性最好。在TGEV感染LLC-PK1细胞的体外模型上进一步评价，结果显示，与病毒单独感染组相比，不同浓度芹黄素处理后能够显著降低病毒的滴度、病毒的基因拷贝数(P<0.01),显著降低MMP3及其下游蛋白(IL-1β)的表达量，显著降低p65和IκBα的磷酸化水平。综上所述，芹黄素可以通过多靶点、多通路抑制TGEV感染，且可能是通过作用于MMP3及其上、下游蛋白调控NF-κB-MMP3-IL-1β信号通路发挥作用。

旨在研究Mito TEMPO对液态保存猪精液效果的影响。保存液中分别添加0、0.5、5.0、50.0、500.0μmol/L的Mito TEMPO,稀释后的猪精液在17℃下液态保存1～5 d。检测保存后的精子活力、顶体完整性、质膜完整性、活性氧(ROS)含量、总抗氧化能力和线粒体膜电位。通过体外受精试验检测保存5 d精子的受精能力及其胚胎发育能力。结果表明，在保存液中添加5.0、50.0μmol/L的Mito TEMPO能显著降低ROS的含量，显著提高精子的活力、质膜完整性、顶体完整率、线粒体膜电位和精子抗氧化能力，还可提高保存后精子的受精及胚胎发育能力。因此Mito TEMPO有助于猪精液液态保存，可为液态精液保存液的研制提供依据。

为了解青藏高原牦牛源肠球菌流行情况及其耐药性、毒力基因特点、生物被膜黏附能力情况，从青藏高原4省区(西藏自治区、四川省、甘肃省、青海省)采集新鲜牦牛粪样346份，奶样311份，共计657份，对其进行细菌分离鉴定，16S rDNA基因检测并构建系统进化树。使用PCR方法对分离菌株进行耐药、毒力基因检测，利用18种抗菌药物进行药敏试验；采用改良半定量结晶紫染色法确定分离菌株生物被膜黏附能力。结果显示，肠球菌总分离率为32.27%,其中四川省最高，达60.23%,其次甘肃省、青海省和西藏自治区，分别为42.70%、23.47%和18.31%。从样品种类来看，粪样分离率为36.71%,奶样为27.33%。经PCR扩增得到约1 400 bp目的条带，选取5株菌株进化分析单独聚成一簇。212株分离菌对克林霉素、庆大霉素、利奈唑胺、利福平、链霉素产生较高耐药性，并存在多种耐药现象，占60.85%。12种耐药基因只有5种被检测出，分别为erm(B)、tet(L)、tet(O)、tet(M)和ant(6)-Ia。13种毒力基因均有在肠球菌中检测出，其中cpd检出率为95.75%,gelE为91.98%,efaA为86.79%,asal为86.32%,其余的在5.19%～55.66%之间。而奶源肠球菌中暂未检测出fsr毒力基因。分离菌中强黏附能力占3.30%,弱黏附能力占48.58%,无黏附能力占48.11%。综上研究揭示了牦牛源肠球菌流行情况、耐药基因和毒力基因携带情况、生物被膜表型相关性，为掌握青藏高原牦牛源肠球菌研究数据奠定了基础。

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒种1(porcine reproductive and respiratory syndrome virus 1,PRRSV1)在河南省的流行情况，本研究对河南省部分规模化猪场临床病料进行分子流行病学调查与病毒分离鉴定。利用PRRSV1 ORF5基因特异性引物进行RT-PCR检测与序列测定，结果共检测出PRRSV1阳性样品8份，获得ORF5基因序列6个，全基因序列1个。利用PAM细胞成功分离出1株PRRSV1,命名为HENZMD-10。对分离毒株基因遗传变异分析，获得的6个ORF5基因均为PRRSV1,分离毒株ORF5基因遗传变异较大，遗传进化树上分属于不同的分支。其中，HENJZ-11、HENJY-7、HENJY-8遗传进化距离较近，分属于同一分支。HENZMD-10分离株基因组全长为15 071 bp,核苷酸序列比对与LV毒株核苷酸相似性为89.1%;与PRRSV2 ATCC-VR2332毒株核苷酸相似性为62.1%;与美国NADC30毒株核苷酸相似性为61.5%;与国内JXA1毒株核苷酸相似性为61.6%。全基因组遗传进化分析显示，HENZMD-10与国内分离PRRSV1毒株NVDC-NM1-2011、LNEU12和FJEU13毒株的遗传距离较近。结果表明，本试验通过对河南省PRRSV1的分子流行病学调查以及病毒全基因遗传进化分析，成功分离1株PRRSV1,为PRRSV1在国内的流行动态及其防控提供一定的临床指导意义。