为建立一种能鉴别鸡星状病毒(chicken astrovirus, CAstV)和禽肾炎病毒(avian nephritis virus, ANV)的二重荧光RT-LAMP,该研究对比GenBank中下载的CAstV ORF1b基因和ANV ORF1b基因保守序列，分别设计了2套特异性引物和标记荧光基团的探针。在CAstV探针3′端标记FAM荧光基团，5′端标记淬灭基团BHQ1;ANV探针3′端标记CY3荧光基团，5′端标记淬灭基团BHQ2,通过试验筛选出最适引物和探针浓度并进行反应条件的优化。用建立的二重荧光RT-LAMP进行特异性、敏感性、重复性和干扰性试验，并对采集自广西南宁不同地区的临床样品共300份进行检测，结果与RT-qPCR和RT-PCR比较，验证该方法的有效性。试验结果显示：建立的二重荧光RT-LAMP方法60 min即可反应结束，最适反应温度为65℃;设计的引物仅能检测CAstV和ANV,而对其他病源无交叉反应；CAstV最低检测限度为1.4×10～2 copies/μL,ANV最低检测限度为1.5×10～2 copies/μL,且干扰性试验和重复性试验良好；检测结果与RT-qPCR相比，CAstV和ANV检测结果符合率分别为97.97%和98.85%。综上所述，该研究建立的二重荧光RT-LAMP方法具有快速、准确、特异性好、灵敏性高、重复性好等特点，适用于临床诊断，为CAstV和ANV的流行病学调查提供技术支持。