猪丁型冠状病毒(PDCoV)是近年来新发现的冠状病毒，可引起仔猪严重的腹泻、呕吐、脱水甚至死亡。S蛋白是PDCoV的重要结构蛋白，决定着病毒的宿主或组织嗜性，也是研制PDCoV疫苗和检测方法的重要靶点。为制备PDCoV S蛋白的单克隆抗体，本研究基于国内PDCoV流行毒株S蛋白胞外域序列，构建S蛋白重组质粒转化DH10Bac感受态细胞，经蓝白斑筛选及PCR鉴定重组Bacmid,通过昆虫-杆状病毒系统表达S蛋白。将获得的S蛋白免疫BALB/c小鼠，并以免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，通过间接ELISA方法和亚克隆筛选出稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞。免疫印迹和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定出5株(2E5、4D5、5D10、2F7和5A9)特异性识别S蛋白的杂交瘤细胞。中和试验表明，3株单克隆抗体(2E5、4D5和5D10)具有病毒中和作用。本研究成功表达了S蛋白及制备了5株能稳定分泌与PDCoV病毒和S蛋白特异性结合的单克隆抗体，为进一步研究S蛋白的结构与功能、PDCoV感染的检测方法开发、预防或治疗用制剂等研究奠定了重要基础。