为了解当前湖南省猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus, PRV）流行及遗传变异情况，本研究于2021—2022年从湖南省部分地区采集18 861份血清样品和1 725份疑似感染PRV组织样品，分别采用ELISA法和qPCR检测血清样品PRV-gE抗体和组织样品PRV核酸，并统计不同年份和季节样品阳性率。同时，对15份PRV阳性样品gC基因序列进行PCR扩增、测序及序列分析，并将阳性病料接种于Vero细胞，初步探究分离株生物学特性。结果发现，2 004份血清和56份组织样品分别检测为PRV-gE抗体和PRV核酸阳性，阳性率分别为10.74%和3.25%。序列分析结果表明，15份PRV阳性样品的gC基因核苷酸和对应氨基酸序列相似性分别为98.4%～100.0%和98.8%～100.0%。遗传进化分析结果显示，13个阳性样品与已知PRV变异株同属于一个分支，而另外2个样品与已知PRV经典株聚为同一个分支。病毒分离获得1株PRV变异株，该毒株可引起Vero细胞出现典型病变，病毒最高滴度为10^8.2 TCID₅₀/mL。本研究揭示出PRV在湖南省各地区广泛流行，且流行基因型包括PRV变异株和经典株，其中变异株为优势流行亚型，为探究湖南省PRV分子流行病学特征及疫苗研发提供了科学依据。