非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是一种猪的急性、热性、高度接触传染性出血性传染病，具有高度致死性，给养猪业造成巨大经济损失。ASF的实验室确诊目前多采用特异性核酸扩增技术，但该方法受多种因素影响，尤其是环境中核酸扩增产物的污染给扩增结果判定带来诸多困扰。为了对ASF临床样品进行高通量诊断检测，本研究以ASF阳性猪血清IgG为捕获抗体，HRP标记的p72单克隆抗体为检测抗体，以细胞培养的非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）绘制标准曲线，建立了双抗体夹心ELISA抗原检测方法，并评价了其敏感性、特异性和重复性，进一步比较了不同因素对抗原检测的影响。结果显示，本研究建立的夹心ELISA检测方法对重组蛋白和ASFV的最低检测限分别为0.1 mg/L和10^3.7 TCID₅₀/mL,与5种常见致病性猪源性病毒均不发生交叉反应，试验批间变异系数小于10%;与实时荧光定量PCR对临床血液病毒检测的总符合率为92%（23/25）。在对灭活ASFV抗原的检测中证明，BEI灭活会显著降低ASFV抗原检测的灵敏度，铝胶佐剂和纳米佐剂会干扰抗原的检出。综上，本研究建立的双抗体夹心ELISA抗原检测方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性，与qPCR法有良好的一致性，为ASFV临床诊断以及灭活ASFV抗原评价提供了一种高通量检测方法。