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2024年, 第44卷, 第08期　
刊出日期：2024-08-15
  

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  • 双抗体夹心ELISA检测ASFV抗原方法的建立与评价
    李其炫, 岳慧贤, 蒋依倩, 张艳艳, 陈腾, 王述超, 张守峰, 扈荣良
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1579-1584+1592. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.01
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    非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是一种猪的急性、热性、高度接触传染性出血性传染病，具有高度致死性，给养猪业造成巨大经济损失。ASF的实验室确诊目前多采用特异性核酸扩增技术，但该方法受多种因素影响，尤其是环境中核酸扩增产物的污染给扩增结果判定带来诸多困扰。为了对ASF临床样品进行高通量诊断检测，本研究以ASF阳性猪血清IgG为捕获抗体，HRP标记的p72单克隆抗体为检测抗体，以细胞培养的非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）绘制标准曲线，建立了双抗体夹心ELISA抗原检测方法，并评价了其敏感性、特异性和重复性，进一步比较了不同因素对抗原检测的影响。结果显示，本研究建立的夹心ELISA检测方法对重组蛋白和ASFV的最低检测限分别为0.1 mg/L和103.7 TCID50/mL,与5种常见致病性猪源性病毒均不发生交叉反应，试验批间变异系数小于10%;与实时荧光定量PCR对临床血液病毒检测的总符合率为92%（23/25）。在对灭活ASFV抗原的检测中证明，BEI灭活会显著降低ASFV抗原检测的灵敏度，铝胶佐剂和纳米佐剂会干扰抗原的检出。综上，本研究建立的双抗体夹心ELISA抗原检测方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性，与qPCR法有良好的一致性，为ASFV临床诊断以及灭活ASFV抗原评价提供了一种高通量检测方法。
  • 非洲猪瘟病毒核酸可视化检测方法的建立与评价
    刘星岐, 白玉洁, 张梦瑶, 黄静波, 刘光亮, 李媛媛, 谭树义, 张海丽, 张艳, 曹宗喜, 王化磊, 黄培
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1585-1592. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.02
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    非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起猪的一种高度传染性病毒性疾病。本病传染性强、致病性高，自2018年以来在我国迅速蔓延流行，对我国生猪养殖业造成了巨大的影响。为实现ASFV的快速检测，本研究将环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)与封闭式核酸可视化试纸相结合，建立了一种检测ASFV B646L基因的核酸可视化方法。该方法在65℃条件下，50 min内可检出1.16 copies/μL的重组质粒，且该方法与猪瘟病毒、猪繁殖和呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪传染性胃肠炎病毒无交叉反应。此外该方法无需特殊设备，操作简便，能有效避免传统等温扩增气溶胶污染造成假阳性的缺点。本研究为ASF疑似感染病例的筛选与早期诊断提供了一种快速、便捷、灵敏、可靠的候选方法。
  • PCV2对仔猪腹股沟淋巴结内IL-15的抑制作用
    张亚楠, 王飞燕, 袁晨, 任静, 苏恺, 岳怀宁, 周双海, 李焕荣, 宋勤叶
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1593-1599+1621. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.03
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    猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）主要损伤猪的免疫细胞，引起淋巴细胞缺失和免疫功能抑制。白细胞介素15 （IL-15）具有广泛的免疫调节功能，对自然杀伤（NK）、CD8+T细胞和NKT细胞等多种免疫细胞的存活、增殖、分化和免疫功能发挥着重要的调节作用。为了明确PCV2对IL-15表达的影响，用PCV2感染4周龄仔猪（n=4）,同时设立阴性对照组（n=4）。感染后7 d,采集感染组和对照组的腹股沟淋巴结，应用猪细胞因子抗体芯片（QAP-CYT-1）定量检测组织中细胞因子的表达量，筛选差异细胞因子，对IL-15进行GO和KEGG富集分析。应用实时荧光定量PCR（qPCR）和ELISA方法在mRNA和蛋白水平上对IL-15的差异表达进行验证，并同时检测猪外周血单个核细胞（PBMC）和血清中的IL-15水平。与对照组相比，感染组的IL-15水平显著降低（P<0.05）;IL-15主要参与细胞因子与细胞因子受体相互作用、免疫应答、细胞活化，以及JAK-STAT和TNF信号通路等的调节过程；感染组的腹股沟淋巴结IL-15 mRNA和蛋白水平均显著低于对照组（P<0.05）,与QAP-CYT-1的检测结果一致。但同时检测的PBMC和血清中的IL-15 mRNA与蛋白水平没有显著差异。上述结果表明，PCV2对仔猪腹股沟淋巴结微环境内IL-15具有抑制作用。该研究可以为进一步揭示PCV2的免疫抑制机制提供重要信息。
  • PEDV与TGEV双重荧光RT-LAMP检测方法的建立与评价
    臧冉, 徐飞飞, 郑丹阳, 赵治钤, 赵谜, 王慧, 高洁, 穆杨
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1600-1610. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.04
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    为建立可快速鉴别检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV)的双重荧光RT-环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)方法，从GenBank下载PEDV和TGEV不同毒株M基因序列进行比对后，针对高度保守区设计合成内、外引物对和探针，在PEDV探针5′端标记FAM基团，3′端标记BHQ1基团，在TGEV探针5′端标记CY5.5基团，3′端标记BHQ2基团，对反应条件和体系优化后建立了一种快速鉴别PEDV和TGEV的双重荧光RT-LAMP检测方法。采用建立的方法在63℃水浴锅中反应60 min,然后再85℃作用10 min结束反应，将反应管置于多色荧光成像仪，在520、690 nm双通道下即可观察结果。用该方法检测其他猪常见病毒性病原均无交叉反应；以10倍稀释的重组质粒为模板评价该方法的灵敏度，结果最低检测限为10～2拷贝/μL重组质粒，是常规RT-PCR方法敏感度的10倍。从175份有腹泻症状仔猪的肛拭子样品中采用建立的方法共检出PEDV阳性样品72份，TGEV阳性样品49份，PEDV和TGEV混合感染样品40份，均比采用常规RT-PCR方法的检出率高。本研究建立的双重荧光RT-LAMP方法采用普通水浴锅即可进行扩增反应，而无需对反应产物进行凝胶电泳，为快速方便的进行PED与TGE的鉴别诊断和PEDV与TGEV混合感染的同步检测提供了技术支撑。
  • 2020-2022年山东地区H9N2亚型禽流感病毒的遗传进化分析
    薛瑞雪, 孙海峰, 邢林林, 姜子昕, 李玉杰, 陈峰, 蔺晓月, 兰邹然, 张月, 王贵升
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1611-1621. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.05
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    为了解山东省H9N2亚型禽流感病毒（avian influenza virus, AIV）流行及遗传变异情况，采用H9亚型AIV荧光定量RT-PCR方法对采集自山东部分地区有呼吸道症状养鸡场的492份鸡气管和肺脏组织样品进行检测，并对检测出的阳性样品进行鸡胚接种，利用Illumina Miseq测序平台将分离株进行全基因组测序，并构建了进化树，分析了与流感病毒传播能力及致病性相关的关键氨基酸位点的特征。结果显示，492份样品中有72份为H9亚型AIV阳性，阳性率14.63%,阳性样品经鸡胚传代后获得34株H9亚型AIV,通过全基因组测序后分析可得34株分离株均为H9N2亚型AIV。通过HA和NA基因进化树分析，34株分离株HA基因均属于Y280-like分支，NA基因均属于F/98-like分支，在此分支基础上，均存在明显的时间节点小分支，一支为“2013年以前分离株”分支，一支为“2013年以后分离株”分支。分离株HA裂解位点均为325PSRSSR↓GLF333,符合低致病性AIV特征，所有病毒均发生了Q226L具有结合哺乳动物α-2,6受体的能力的氨基酸位点突变。内部基因哺乳动物适应性关键氨基酸位点中，所有病毒PB1蛋白发生了I368V增强病毒在哺乳动物传播能力的氨基酸位点突变，部分毒株PB2蛋白发生I292V和A588V哺乳动物适应性增强的氨基酸位点突变。结果表明，山东省H9N2亚型AIV各基因节段存在不同程度的重组和基因变异情况，需加强病毒变异监测。
  • 蛋白酶抑制剂DUBs-IN-1抑制马立克病病毒在鸡细胞内的增殖
    艾馨, 许家翠, 谢佳良, 马浩原, 于凯, 刘洺丞, 王馨悦, 林俊彦, 高旭
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1622-1628. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.06
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    接种疫苗是防御鸡马立克病的主要手段，但疫苗不能扼制马立克病病毒(MDV)的感染、增殖、传播以及毒力增强，因此，抑制MDV在鸡细胞内的增殖是增强疫苗防御效果的重要手段。本研究以MDV编码的大被膜蛋白MDV049为靶点，应用泛素探针从蛋白酶抑制剂库中筛选出一种化合物DUBs-IN-1,可抑制MDV049的酶活性。分子对接分析发现，DUBs-IN-1可以与MDV049的催化活性中心袋口处的7个残基互作，阻止泛素底物与活性中心的CYS98结合，进而抑制MDV049酶的活性。应用CEF细胞病变(CPE)模型研究发现，0.35、0.70μmol/L的DUBs-IN-1可显著抑制MDV所致的CPE,定量分析揭示DUBs-IN-1可显著抑制MDV在CEF细胞内的增殖(P<0.01)。应用感染MDV的鸡进行动物水平的研究发现，使用80和150μg/kg的DUBs-IN-1每日给药处理，DUBs-IN-1可显著抑制MDV在鸡T细胞内的增殖(P<0.01)。总之，本研究发现蛋白酶抑制剂DUBs-IN-1通过竞争性抑制方式抑制MDV049酶活性，并有效抑制MDV在鸡细胞内增殖，这一发现为研发抗MDV的药物奠定了理论基础。
  • 环状RNA mmu＿circ＿0001083对牛肠道病毒HY12复制的影响
    张芷源, 张群, 章凡, 崔续媛, 郑学博, 胡俊英, 常晓冉, 张福慧, 王新平
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1629-1638. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.07
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    环状RNA(circRNA)是一类特殊的呈闭合环状结构的非编码RNA,参与多种生物学过程，如细胞增殖、分化和凋亡，在多种疾病发生中发挥重要作用，同时也是潜在的生物标志物和治疗靶点。为探索circRNA对病毒复制的影响，本研究对HY12肠道病毒感染MC38细胞的circRNA差异表达进行了组学测定与分析，发现在HY12病毒感染后有570个circRNA表达水平上调，381个circRNA表达水平下调。在570个表达上调的circRNA中，选择差异显著上调的circRNA mmu＿circ＿0001083为研究对象，探讨其与HY12感染之间的关联以及对病毒复制的影响。结果显示，HY12病毒感染细胞后，宿主环状RNA mmu＿circ＿0001083的表达显著上升，且其表达水平呈现病毒剂量与时间依赖性。与感染正常MC38细胞相比，HY12病毒感染环状RNA mmu＿circ＿0001083敲低的MC38细胞后，其2C蛋白表达减少，病毒滴度显著降低。相反，HY12病毒感染过表达环状RNA mmu＿circ＿0001083的MC38细胞后，其2C蛋白表达增加，病毒滴度明显升高。上述结果表明，宿主环状RNA mmu＿circ＿0001083的表达上调与HY12病毒感染复制呈显著正相关，即mmu＿circ＿0001083对HY12的复制起到了正向调控的作用，该结果为今后深入研究环状RNA对HY12病毒复制的调控机制打下基础。
  • 蓝舌病病毒感染对BHK-21细胞中Ⅰ型干扰素应答的影响
    罗世美, 陈韵伊, 李其沙, 周艳梅, 王怡斐, 廖芯玉, 胡雪柔, 魏远健, 李梦琴, 朱萌, 张迅, 陈贝蕊, 马鲜平, 谢佳芮, 寇美玲, 苗海生, 李芳, 易华山
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1639-1644+1690. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.08
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    蓝舌病病毒(bluetongue virus, BTV)是一种严重危害绵羊等反刍动物的一种虫媒病毒，为研究蓝舌病病毒感染与宿主细胞干扰素抗病毒免疫应答的分子机制。研究以感染复数(MOI)为1的BTV诱导18、24、36 h的BHK-21细胞通过实时荧光定量PCR分析干扰素通路基因mRNA表达特征，以及Western blot分析MDA5、TRAF3、RIG-Ⅰ和TBK1蛋白表达。结果表明，在诱导24 h时，干扰素信号通路基因表达的变化最为明显，IFN-α、IFN-β、RIG-Ⅰ、TBK1、MDA5、VISA、TRAF3基因的mRNA表达水平呈上调表达，而IKKε、TRAF6基因的mRNA表达水平呈下调表达，在蛋白水平上MDA5、TBK1蛋白上调表达而RIG-Ⅰ、TRAF3蛋白下调表达，表明BTV感染诱导BHK-21细胞中Ⅰ型干扰素免疫应答，为进一步探究IFN-Ⅰ信号通路调控基因在BTV感染的宿主细胞抗病毒免疫机制研究奠定基础。
  • 多动物链球菌诱导巨噬细胞驯化的免疫活性
    都心怡, 高宇, 骆雪月, 杨勇军, 刘真真
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1645-1650. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.09
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    旨在筛选分离驯化巨噬细胞的细菌，并鉴定其驯化效应分子。从牛、羊粪便中分离和纯化细菌、制备发酵上清，并通过小鼠腹腔巨噬细胞模型，进行一氧化氮(NO)测定和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的ELISA分析来研究驯化活性，活性细菌进行16S rRNA基因序列鉴定、生长曲线测定，并经饱和硫酸铵沉淀进行NO测定和TNF-α的ELISA分析来研究驯化后巨噬细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬能力。结果显示，筛选获得1株具有驯化免疫作用的菌株ED-8,经16S rRNA基因序列比对显示其与多动物链球菌具有99.86%的相似性，分类为多动物链球菌。其发酵上清可显著提高巨噬细胞NO和TNF-α的分泌，驯化后巨噬细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬能力也增强，且经粗提处理后仍保留此效应，表明具有免疫调节活性。结果表明，本试验成功分离到多动物链球菌ED-8,其分泌物能够诱导巨噬细胞的免疫驯化，增强其吞噬活性。
  • 多浪羊瘤胃源乳酸菌的分离鉴定及其生物学特性
    段石玉, 王子璇, 朱怡平, 毛明伟, 司衣提·克热木, 肖国亮, 王生月, 李靖, 张乃生
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1651-1658+1734. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.10
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    益生菌在目前高强度育肥的背景下逐渐成为具有替代抗生素潜力的饲料添加剂，在畜禽养殖中应用具有抑制病原菌增殖、维持消化道内微生态平衡、提升机体免疫功能等益生作用。为筛选具有潜在益生效果的乳酸菌菌株，本试验采用CaCO3-MRS固体培养基从健康多浪羊瘤胃液中分离出23株产酸菌株，通过初筛、溶血试验复筛出4株安全菌株，经耐受性试验筛选出相对适合瘤胃内环境的1株待测菌株进行后续试验，该菌株在pH3.0条件下存活率为93.80%,胆盐浓度0.30%条件下存活率为59.72%,且高温条件下存活率较高。后续采用形态学观察、分子生物学鉴定、病原株拮抗能力测定、抗生素耐药性分析、生长特性检测等方法对其展开研究。结果表明，待测菌株为革兰阳性杆菌，经16S rRNA基因序列比对，该菌为唾液乳杆菌，可作为候选菌株开发为益生菌制剂，研究结果为其在多浪羊养殖的应用奠定了基础。
  • 唾液乳杆菌CICC23174全基因组测序及功能分析
    王丽屏, 邓玲聪, 王大红, 王茂鹏, 尹革芬
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1659-1666. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.11
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    为探究唾液乳杆菌CICC23174的生物学特性和基因功能，本研究以从鸡肠道分离得到的唾液乳杆菌CICC23174为研究对象，通过使用二代测序平台HiSeq2000进行测序，利用多种生物学信息软件对原始数据进行组装和优化，并对其基因信息进行功能注释、细菌素和信号肽预测、基因共线性比较和分子进化树分析。基因预测结果表明，唾液乳杆菌CICC23174基因组大小为203 542 bp, GC含量约为32.84%,基因组特征显示其编码基因1 890个，含有3个细菌素和50个信号肽。重要的是，唾液乳杆菌CICC23174菌株含有27个特有基因，构成4个系统分别为Ⅰ型-CRISPR-Cas基因防御系统、Ⅱ型毒素-抗毒素系统、抑制肿瘤逃逸基因和蛋白分泌途径。而且基因共线性分析发现CICC23174菌株与模式菌株UCC118唾液乳杆菌最为相似，但是16S rRNA分子进化树结果表明CICC23174菌株与唾液乳杆菌FZJTZ9M6遗传距离较近。本研究结果为丰富唾液乳杆菌的物种进化库，挖掘唾液乳杆菌潜在益生功能奠定了基础。
  • 猫TNF-α蛋白的原核表达及阻断活性单克隆抗体的制备
    王阅, 李佳康, 李秋燕, 曹胜波, 叶静, 曹龙龙, 周登元
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1667-1673. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.12
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    为制备针对猫TNF-α的具有阻断活性的单克隆抗体，本研究基于可溶性猫TNF-α(sTNFα)基因成功构建、表达及纯化了重组质粒pET-28a-sTNFα,并进一步对重组蛋白诱导表达的条件进行摸索和优化，鉴定其生物活性；其次将猫TNF-α重组蛋白作为免疫原进行小鼠免疫、细胞融合、阻断活性杂交瘤细胞的筛选和腹水制备，并对获得的单克隆抗体进行鉴定。结果显示，成功构建了pET-28a-sTNFα质粒并通过大肠杆菌系统表达出具有生物活性的猫TNF-α重组蛋白，相对分子质量为34 kDa,半数细胞活性抑制质量浓度为1.22μg/L;成功筛选出3株具有阻断活性的单克隆抗体(A6-B7-9、H5-E2-94和C8-A10-100),Western blot检测显示3株单抗均能与TNF-α特异性结合，效价可达1∶512 000,3株单抗在质量浓度为100 mg/L时，对TNF-α的拮抗效果最强。本研究筛选了猫TNF-α的阻断活性抗体，以期为由猫TNF-α介导的相关疾病的防治提供新型的安全的有效的候选药物。
  • 奶牛骨髓源单核巨噬细胞诱导培养方法建立鉴定及应用
    王钰, 杨效林, 郭莉莉, 龚鹏飞, 吴敬泽, 毛伟, 张双翼, 刘博, 曹金山
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1674-1681. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.13
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    为了建立奶牛骨髓源巨噬细胞的分离培养与鉴定方法，选用3种不同的培养基（RPMI-1640、DMEM、DMEM/F12）分别添加20%胎牛血清（FBS）、2.4%青-链霉素、1.2%谷氨酰胺（Gln）、M-CSF（20μg/L）将奶牛骨髓中提取出的单核细胞诱导为巨噬细胞，再通过加入脂多糖（Lipolyaccharide, LPS）将诱导出的M0型巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞，光学显微镜在第1、4、7天观察巨噬细胞形态，比较3种培养基对分化巨噬细胞的差异。同时探究了前列腺素D2（Prostaglandin D2,PGD2）-DP2受体途径对大肠杆菌（Escherichia coli）诱导细胞因子（IL-6、TNF-α）分泌及巨噬细胞吞噬功能的影响。结果显示，RPMI-1640培养基中培养的细胞形态变化最为明显，且数量较多。并能够检测到大量的单核巨噬细胞特征性标志物（M0标志物：CD11b、CD14;M1标志物：CD11b、CD80）的表达，M0和M1型巨噬细胞纯度分别为79.9%和93.5%。与空白对照组相比，E.coli感染组COX-2和H-PGDS基因表达显著升高；PGD2分泌量也显著上升（P<0.000 1）。DP2受体抑制剂（CAY10471、CAY10595）能够显著抑制E.coli诱导促炎性细胞因子（IL-6、TNF-α）的分泌和显著增强巨噬细胞对E.coli的杀伤作用。结果表明，诱导的细胞具有巨噬细胞特有的形态学特征和免疫表型；E.coli可诱导巨噬细胞PGD2的产生，PGD2-DP2途径对E.coli感染的巨噬细胞细胞因子的分泌具有一定的调控作用。
  • 狂犬病病毒感染N2a细胞引起的转录体差异表达
    刘晓敏, 郭艺迪, 果鑫, 张艳楠, 王重阳, 汪滋辰, 张丹玮, 张茂林
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1682-1690. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.14
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    狂犬病是一种人畜共患疾病，对全球公共卫生构成极大威胁。狂犬病病毒(RABV)呈嗜神经性传播，会引发宿主严重的神经功能紊乱，致死率几乎100%。为鉴定RABV影响神经细胞功能的重要基因，本研究采用RNA测序(RNA-seq)方法建立并分析了固定毒株CVS-11感染小鼠神经母细胞瘤细胞(Neuro-2a, N2a)的mRNA表达谱，并通过基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析确定差异表达基因(DEGs)。结果显示，在CVS-11毒株感染的N2a中，共有415个差异表达基因，其中89个为上调基因，326个为下调基因。差异表达基因涉及多种生物学过程，包括轴突传导信号通路、胆固醇代谢通路、氮代谢信号通路、鞘糖脂生物合成信号通路等，其中多种DEGs已被证明与RABV感染密切相关，从中挑选出12个与轴突传导、抗原处理与呈递等通路相关的差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证，其变化趋势与RNA-seq结果一致。本研究检测了神经细胞在RABV感染条件下基因转录组变化，为探究RABV感染对神经细胞功能的影响机制提供了新的线索。
  • 一株产气荚膜梭菌烈性噬菌体的分离鉴定及特性分析
    李梦娇, 宋战昀, 刘博, 许智强, 刘月, 王秋霖, 冯新
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1691-1697. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.15
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    产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种常见的革兰阳性厌氧条件致病菌，在自然界中广泛存在，可引起腹泻、气性坏疽等疾病。临床上采用抗生素治疗产气荚膜梭菌感染，但细菌会通过突变、耐药质粒传播等方式产生耐药性，使产气荚膜梭菌在抗生素的环境压力下得以存活。因此寻找和开发新制剂来替代抗生素或作为饲料添加剂以定向清除机体携带的产气荚膜梭菌或预防感染是十分重要的。本研究从污水中分离得到了一株产气荚膜梭菌烈性噬菌体vB＿CPP＿AT。利用透射电镜观察噬菌体形态，通过裂解谱、MOI、酸碱及温度耐受性等分析该产气荚膜梭菌噬菌体基本生物学特性。研究发现vB＿CPP＿AT噬菌体为短尾噬菌体，在60 min时呈暴发式增长，最佳MOI为0.1,专一性裂解产气荚膜梭菌，裂解率为40%(8/20),与参试的其他细菌不发生裂解反应，具有良好的热稳定及酸碱耐受性。vB＿CPP＿AT噬菌体基因组为双链DNA,全长16 790 bp,具有20个开放阅读框。基因组分析vB＿CPP＿AT噬菌体为1株新的产气荚膜梭菌烈性噬菌体。该结果为噬菌体vB＿CPP＿AT应用于产气荚膜梭菌的临床治疗奠定了基础。
  • 检测寨卡病毒核酸的RT-LAMP可视化方法的建立
    宋雨濛, 黄培, 金宏丽, 焦翠翠, 白玉洁, 张梦瑶, 龚志远, 李媛媛, 张海丽, 王化磊
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1698-1703. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.16
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    为建立简单、便捷、灵敏、特异的寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)快速检测方法，本研究通过对不同时间、不同地区分离的ZIKV全基因组序列进行分析，筛选ZIKV NS5基因保守区为靶标，同时设计特异性引物及探针，结合RT-LAMP恒温扩增技术和免疫层析技术，成功构建ZIKV反转录环介导等温扩增核酸可视化(RT-LAMP-VF)检测方法。结果显示，该方法具有良好的特异性和敏感性，当内、外、环引物比为FIP∶LF∶F3=4∶2∶1时，在61℃条件下恒温扩增45 min,可特异性检测到10～2 copies/μL的RNA标准品以及2.15 pfu的ZIKV,且与其他黄病毒(日本乙型脑炎病毒、猪瘟病毒)等无交叉反应。血液组织中的其他RNA不影响RT-LAMP-VF的敏感性和特异性，表明该方法可用于临床样本ZIKV的检测。本研究建立的ZIKV RT-LAMP-VF检测方法操作简单、不需要特殊仪器设备，尤其适用于基层单位ZIKV的现场快速检测，为ZIKV病的现场快速检测和预警预报体系的建立提供技术支持与物质保障。
  • 发热伴血小板减少综合征病毒Gn蛋白D Ⅲ-Ⅲ的表达与抗体间接ELISA检测方法的建立
    张梦瑶, 梁天来, 闫飞虎, 陈韬, 焦翠翠, 金宏丽, 栾娇彦, 吴晓, 黄培, 张海丽, 宁琴, 王化磊, 李媛媛
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1704-1712. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.17
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    利用PCR技术扩增发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV)Gn-DⅢ-Ⅲ基因，将其插入pET-30a(+)原核表达载体，构建重组质粒pET-SFTSV-Gn-DⅢ-Ⅲ,将测序正确的pET-SFTSV-Gn-DⅢ-Ⅲ转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，优化Gn-DⅢ-Ⅲ蛋白表达表达条件。利用镍柱亲和层析法纯化的Gn-DⅢ-Ⅲ蛋白作为包被抗原，建立检测SFTSV抗体的间接ELISA方法，并进行评价。结果显示，通过PCR和测序鉴定重组质粒pET-SFTSV-Gn-DⅢ-Ⅲ构建成功；重组Gn-DⅢ-Ⅲ蛋白为可溶性表达，其最佳诱导条件为：0.4 mmol/L IPTG于25℃诱导4 h;经镍柱纯化后蛋白纯度高达91.77%;SFTSV抗体间接ELISA检测方法的的最佳反应条件为：5 mg/L的包被质量浓度，一抗在37℃孵育1.5 h,二抗1∶10 000稀释后在37℃孵育1 h。特异性试验结果显示该方法与裂谷热病毒(Rift Valley fever virus; RVFV)、埃博拉病毒(Ebola virus, EBOV)和蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus, TBEV)阳性血清均无交叉反应；敏感性试验结果显示该方法有较高的敏感性，SFTSV阳性血清稀释至81 920倍时其P/N仍大于2.1;重复性结果表明批内和批间反应变异系数均小于10%。应用所建立方法检测了4份人类感染SFTSV不同阶段的临床血清样本，结果缓解期患者血清P/N值大于2.1,为阳性，多器官衰竭期患者血清P/N值小于2.1,为阴性。结果表明，本研究成功表达并纯化了SFTSV Gn-DⅢ-Ⅲ蛋白，并以此为包被蛋白建立SFTSV抗体间接ELISA检测方法，该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，可用于检测人类SFTSV临床血清样本。
  • 2021-2022年我国新疆维吾尔自治区家畜流行性乙型脑炎病毒检测
    李冰, 高岩, 曹鑫宇, 仇相书, 秦爱建, 张赫, 金宁一
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1713-1718. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.18
    摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏
    基于建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法，检测新疆部分地区家畜血清样品中流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)的流行情况。利用PCR扩增JEV毒株的E基因片段，将其克隆到pEASY-Blunt载体，构建重组质粒，建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法，并验证其灵敏度、特异性和重复性。收集2021-2022年新疆哈密、阿勒泰、伊犁、阿克苏、喀什地区家畜血清样品，应用建立的检测方法进行检测并分析阳性率，以监测新疆地区JEV在家畜中的流行情况。结果显示，建立的检测方法呈良好的线性关系，检测区间在4.03×10～2～4.03×10～9拷贝/μL,相关系数为0.995,斜率为-3.431,灵敏度下限极值为4.03×10～2拷贝/μL。该方法用于检测寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)、登革病毒(Dengue virus, DENV)未出现特异性扩增。重复性的组内变异系数为0.53%～1.27%,组间变异系数为0.48%～1.43%。使用本方法检测2021-2022年新疆地区家畜血清样品，总阳性率为3.11%,其中马、牛和羊中的阳性检出率分别为2.35%、5.26%和3.74%,鉴定为基因Ⅰ型JEV。结果表明，建立了基因Ⅰ型JEV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法，新疆地区马、牛、羊血清中均检测到JEV,总阳性率为3.11%。
  • 植物乳杆菌表达重组新冠病毒M抗原表位及免疫原性分析
    邓安琦, 叶丹妮, 艾雪言, 唐秀兰, 陈文聪, 陈嘉豪, 郝嘉翼, 邓玲聪, 李昌, 陈永福, 金俊杰, 王茂鹏
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1719-1727. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.19
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    新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是引起新冠肺炎的病原体，其变异快、传播强，导致疫情广泛流行，以疫苗接种为主要防控措施。尽管已有大量新冠肽表位疫苗和黏膜型疫苗的研究，但靶向黏膜的肽表位疫苗和其功能评价的研究鲜有报道。本研究以IEDB数据库预测SARS-CoV-2结构蛋白M肽表位作为抗原靶点，设计含3050及1229信号肽和DCpep优化的MS-3S基因，插入MS2噬菌体衣壳蛋白中，通过PCR和无缝克隆技术构建表达质粒pSIP:MS-3S,转化到植物乳杆菌LP18中获得重组菌LP18:MS-3S。通过对诱导时间、诱导剂质量浓度、转速和初始pH值等表达条件进行优化及鼻内免疫实验，验证重组菌免疫效果。结果显示，获得出916 bp修饰和优化的目的基因MS-3S,并成功构建重组菌LP18:MS-3S,经Western blot、流式细胞术、免疫荧光等检测方法验证，获得重组蛋白表达的最佳条件：诱导时间为4 h,诱导肽质量浓度为100μg/L,培养基初始pH值为7.0,转速为100 r/min。通过ELISA试验验证，在小鼠的血清、肺泡灌洗液和粪便稀释液中，检测出抗肽表位的特异性抗体。本研究成功构建了1株表达新冠M蛋白肽表位抗原的重组菌，并且可诱导机体产生体液和黏膜免疫，为新冠黏膜免疫候选疫苗的研制奠定了基础。
  • 痘苗病毒蛋白D8纳米抗体的原核表达及结合活性分析
    田婧婧, 杨晓岚, 李涛, 王慧, 范瑞文
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1728-1734. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.20
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    利用SUMO标签制备痘苗病毒(vaccinia virus, VACV)蛋白D8的纳米抗体，并分析其与抗原是否具有结合活性。设计并合成序列，构建原核表达质粒pKMD-SUMO-D8,将其转化大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达；纯化带有His标签和SUMO标签的抗体Anti-SUMO-D8,之后利用SUMO蛋白酶切除His标签和SUMO标签，进一步获得Anti-D8;最后，应用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)及间接免疫荧光试验(IFA)对其结合活性进行检测并分析。结果显示，成功构建了原核表达质粒pKMD-SUMO-D8和重组菌株，在30℃条件下，终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导表达菌株4 h时，Anti-SUMO-D8表达量最佳；获得了高纯度的Anti-SUMO-D8和Anti-D8纳米抗体；间接ELISA结果显示，Anti-SUMO-D8和Anti-D8与抗原均具有结合活性；在相同条件下，Anti-D8与VACV及E8L的结合活性高于Anti-SUMO-D8。间接IFA结果显示，VACV侵染48 h后，试验组部分细胞核在荧光显微镜下可见绿色荧光。利用SUMO标签可高效制备VACV蛋白D8的纳米抗体，且制备的纳米抗体具有一定的结合活性。本研究结果为纳米抗体的制备提供了新思路，也为深入研究VACV蛋白D8纳米抗体的生物学功能奠定了基础。
  • 马链球菌兽疫亚种荧光定量PCR检测方法的建立及在入境马匹回顾性检测分析中的应用
    胡雨桐, 周学慧, 赵梦茹, 陈翔, 吴晓薇, 赵治国, 王艳, 赵光伟
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1735-1742. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.21
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    为建立一种针对马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subspecies zooepidemicus,SEZ)快速、特异、敏感的检测方法，并了解SEZ在入境我国马匹中的感染情况，试验首先根据SEZ标准菌株(ATCC 43079)的保守基因comB设计合成特异性引物，经PCR扩增后构建pMD19-T-comB重组质粒，以此为标准品模板建立基于SYBR GreenⅠ染料的荧光定量PCR检测方法(quantitative PCR,qPCR);进而利用所建方法对2018―2023年由荷兰、比利时、日本、德国、阿根廷和新西兰等6个国家入境我国口岸的477份马血清样本进行SEZ感染情况的检测分析。结果发现本试验所建立的qPCR检测方法特异性良好，仅对SEZ存在特异性扩增；敏感性试验表明该方法最低检测量为4.58×10～1 copies/μL;重复性试验检测结果显示批内重复性变异系数均小于0.5%,批间重复性变异系数均低于3.0%,表明重复性良好，稳定性高。回顾性检测分析显示2018年荷兰入境的共40份样本均为阴性(0/40);2019年比利时入境样本中检测到1份阳性(1/20),日本和德国入境样本均为阴性(0/36);2021年日本样本中3份为阳性(3/34),阿根廷1份为阳性(1/20),荷兰均为阴性(0/40);2022年荷兰76份样本均为阴性(0/76);2023年荷兰126份样本检出阳性样本5份(5/126),新西兰88份样本中检出阳性1份(1/88)。总计阳性样本11份，阳性率为2.31%(11/477),总体阳性率较低。结果说明，成功建立了用于检测SEZ的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法，其对我国出入境、口岸部门的快速检疫以及该病的流行病学调查等工作提供了必要的技术支撑。
  • 短链脂肪酸丁酸增强巨噬细胞预防问号钩端螺旋体的急性感染
    陈曦, 谢旭峰, 刘鑫, 刘久茜, 张文龙, 曹永国
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1743-1748. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.22
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    钩端螺旋体病(钩体病)是一种全球性自然疫源性人兽共患传染病。研究表明，肠道菌群代谢产物短链脂肪酸参与宿主免疫调节、影响疾病进程。本试验旨在探究肠道菌群代谢产物短链脂肪酸在钩体病中的作用。结果表明，补充短链脂肪酸丁酸能显著提高金黄地鼠钩体病存活率。体外试验表明，丁酸处理抑制感染钩体后巨噬细胞Cat和Gsr基因表达，但上调了NOX1和NOX4基因表达。同时，丁酸刺激增加了感染钩体巨噬细胞ROS水平，而高水平的ROS可增强巨噬细胞杀菌功能。体内试验也证实丁酸通过调节ROS的产生保护金黄地鼠抵抗急性钩端螺旋体病。综上所述，肠道菌群代谢产物短链脂肪酸丁酸通过调节ROS表达增强巨噬细胞杀菌功能，从而保护宿主抵抗钩体病。
  • 巴马香猪与长白猪骨骼肌卫星细胞增殖分化差异
    任思禹, 李颖
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1749-1754+1781. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.23
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    猪肉的质量与猪骨骼肌的发育和肌内脂质沉积有关，而骨骼肌卫星细胞具有分化为成肌细胞、脂肪细胞的潜能。为分析骨骼肌卫星细胞的增殖分化对骨骼肌形成的影响，本研究从长白猪和巴马香猪背最长肌处分离纯化骨骼肌卫星细胞，并利用免疫荧光检测Pax7的表达情况进行细胞鉴定。通过RT-qPCR检测2个品种猪骨骼肌卫星细胞中细胞周期相关因子和成肌成脂相关因子的mRNA表达量，CCK-8检测2种细胞的增殖情况。结果表明，2个品种猪骨骼肌卫星细胞表现出不同的增殖能力和分化潜能：与巴马香猪相比，长白猪骨骼肌卫星细胞表现出较强的增殖能力和较高的成肌分化潜能以及较低的成脂分化潜能。本研究发现不同肉质猪骨骼肌卫星细胞增殖分化能力存在差异，为阐明不同肉质猪骨骼肌形成差异的相关机理提供了理论依据。
  • 三七提取物通过IL-6、CASP3和STAT3调节免疫应激肉鸡炎症反应
    杜林, 杨萍瑞, 周翰林, 邱莉娟, 胡卫东, 曹立亭, 毕师诚
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1755-1764. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.24
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    旨在观察三七提取物对免疫应激肉鸡炎症反应的影响，并通过网络药理学和分子对接结合体内动物试验对其机理进行探讨。根据TCMSP数据库及GeneCard等疾病数据库寻找三七及肉鸡炎症相关靶点，应用Cytoscape 3.7.1和String数据库分别进行关键化合物和靶点的筛选，并构建中药-关键成分-靶点网络关系图；通过DAVID平台进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，依托于chiplot在线网站进行可视化，最后通过Pymol软件对核心聚类蛋白进行分析得到核心作用靶点，使用分子对接技术预测活性成分与核心靶点匹配程度以及动物试验进一步探索三七提取物的药效机制。动物试验将60只1日龄红羽肉鸡，随机分为3组(LPS组、CON组、PN组),试验周期为35 d。LPS组和PN组在第12、14、33和35天以250μg/kg腹腔注射LPS,CON组腹腔注射等量的无菌生理盐水。采用ELISA法检测三七提取物对血清中炎性细胞因子的影响，同时检测各组血清中的激素含量，荧光定量PCR检测各组对STAT3、IL-6和CASP3的mRNA表达水平的影响。结果表明，在第2和5周，LPS攻毒后，血清中IFN-γ、IL-6、iNOS、TNF-α和TNF-β含量显著增加(P<0.05),而IL-10含量显著下降(P<0.05)。而与LPS组相比，基础日粮中添加三七提取物后血清中IFN-γ、IL-6、iNOS、TNF-α和TNF-β的含量显著下降(P<0.05),IL-10含量显著增加(P<0.05),并且三七提取物显著降低了血清中促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质酮(CORT)的水平(P<0.05),提高了生长激素(GH)的水平(P<0.05)。网络药理学共预测了8种有效成分和123个肉鸡炎症的潜在靶点。三七对肉鸡炎症的保护机制可能与C型凝集素受体(CLR)信号通路、Toll样受体(TLR)信号通路、MAPK信号通路、NOD样受体(NLR)信号通路和FoxO信号通路有关。根据预测，三七缓解肉鸡炎症反应可能与作用于12个关键靶点有关。荧光定量PCR显示，三七提取物下调了IL-6和CASP3的mRNA表达(P<0.05),上调了STAT3的mRNA表达(P<0.05)。分子对接结果也显示三七提取物中的有效成分可通过IL-6和CASP3发挥抗炎作用。结果提示，三七提取物可能通过多成分、多靶点、多途径缓解免疫应激肉鸡炎症反应，本研究有利于提出新的治疗策略并为开发以赶黄草提取物为主的饲料添加剂提供理论依据。
  • 去甲泽拉木醛与美罗培南对NDM-1阳性大肠杆菌的协同抗菌作用
    刘智营, 郭岩, 徐蕾, 刘洪涛, 邓旭明, 邱家章
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1765-1772. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.25
    摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏
    旨在探究去甲泽拉木醛与美罗培南对New Delhi Metallo-β-lactamase-1（NDM-1）阳性大肠杆菌的协同抗菌作用。首先通过酶活性抑制试验、分子对接试验确定去甲泽拉木醛对NDM-1蛋白水解活性的抑制作用及机制，其次通过棋盘法-最小抑菌浓度试验、生长曲线试验、药敏试验验证去甲泽拉木醛与碳青霉烯类抗生素美罗培南的协同抑菌作用，进一步通过杀菌曲线试验、活死细菌染色试验、膜完整性试验确定两者的协同杀菌作用，最后通过大蜡螟感染模型验证去甲泽拉木醛与美罗培南的体内治疗效果。结果显示，去甲泽拉木醛能够显著抑制NDM-1的水解活性(IC50=0.32 mg/L),并对美罗培南与NDM-1蛋白的结合产生竞争作用。体外试验表明去甲泽拉木醛与美罗培南有良好的协同抗菌作用，并可通过增加美罗培南对细菌的膜损伤作用发挥协同杀菌作用；体内试验表明去甲泽拉木醛可将美罗培南的保护效果从67%提高至80%。本研究为治疗NDM-1阳性大肠杆菌感染提供了一种治疗策略和抗菌增效剂。
  • 甘草多糖对H2O2诱导肉鸡肝细胞氧化应激损伤的保护作用
    王雪莹, 侯惠宁, 安永升, 卢佳, 李日顺, 张才
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1773-1781. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.26
    摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏
    探讨甘草多糖对氧化应激造成的肉鸡肝细胞损伤的保护作用，并对其作用机制进行研究。以体外培养的原代肉鸡肝细胞为空白对照组，同时设置H2O2诱导组、甘草多糖组、H2O2+甘草多糖组，用CCK-8试剂检测肉鸡肝细胞活性，JC-1和DAPI染色试剂盒检测细胞凋亡，相关试剂盒检测GSH-Px、SOD、CAT、MDA含量和T-AOC水平，qRT-PCR检测肉鸡肝细胞中抗氧化基因Nrf2、Keap-1、GPx1、SOD、CAT和炎症基因TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-4、IL-10的相对表达量。结果表明，与H2O2诱导组相比，甘草多糖预处理可明显提升肉鸡肝细胞活性，减少细胞凋亡；与H2O2诱导组相比，甘草多糖预处理可明显提高细胞GSH-Px、SOD、CAT、MDA含量和T-AOC水平，抑制MDA生成；qRT-PCR检测显示，甘草多糖可显著提高Nrf2、Keap-1、GPx1、SOD、CAT、IL-4、IL-10的相对表达量，同时显著降低MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β的相对表达量。甘草多糖可能通过激活Nrf2信号通路提高抗氧化酶的活性，并抑制TLR4信号通路，从而明显改善肉鸡肝细胞的氧化应激损伤。
  • 基于代谢组学方法研究阿司匹林丁香酚酯对大鼠代谢的影响
    陶琦, 范丽萍, 过海天, 马宁, 刘希望, 杨亚军, 李剑勇
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1782-1792. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.27
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    探究阿司匹林丁香酚酯(aspirin eugenol ester, AEE)对大鼠代谢的影响，首先配制合适浓度的AEE混悬液。将Wistar大鼠随机分为3组，分别为正常组、AEE低剂量组(18 mg/kg)和AEE高剂量组(72 mg/kg)。给药组大鼠每日灌服给药1次，正常组Wistar大鼠每日灌服1次等体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液。连续灌服7 d后收集粪便和尿液，应用超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱法(UPLC-QTOF-MS/MS)对大鼠粪便和尿液进行非靶向代谢组学分析，并进行Metabo Analyst 5.0代谢通路富集分析。结果显示，本试验所选的AEE剂量对大鼠的生长未见影响；在大鼠粪便与尿液中分别鉴定出10个和8个差异代谢物，涉及到的代谢通路主要有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，苯丙氨酸代谢、类固醇激素生物合成、不饱和脂肪酸的生物合成、氨基糖和核苷酸糖代谢、脂肪酸生物合成和β-丙氨酸代谢等。结果表明，给药组大鼠体质量无显著影响(P>0.05),但大鼠的代谢受到影响。粪便代谢物主要涉及的代谢通路包括：不饱和脂肪酸的生物合成、酪氨酸代谢、脂肪酸生物合成和类固醇激素生物合成；尿液代谢物主要涉及的代谢通路包括：嘌呤代谢、脂肪酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢。因此，AEE对大鼠代谢影响主要与调节脂质代谢、氨基酸代谢、能量代谢等密切相关。试验结果为AEE在动物体内药效和临床应用提供一定的理论参考。
  • 壬基酚诱导肝细胞氧化损伤及铁死亡机制研究
    王雨欣, 陈丹娜, 雷卓凡, 邹颜璐, 曹唱唱, 宋泉江, 宋厚辉, 姜胜
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1793-1799. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.28
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    旨在研究壬基酚（nonylphenol, NP）致肝细胞损伤的机制。通过建立NP诱导BRL-3A肝细胞损伤体外模型，评估肝细胞氧化损伤标志物变化、肝细胞Fe2+含量变化，观察肝细胞超微结构，检测铁死亡标志蛋白表达水平。结果显示，NP可引起BRL-3A细胞ROS、MDA显著升高（P<0.05）;GSH含量、GSH-Px活性和SOD活性显著降低（P<0.05）;Fe2+含量显著升高（P<0.05）,并呈现剂量依赖性；BRL-3A细胞线粒体体积明显变小，线粒体嵴断裂甚至消失，有的线粒体呈现空泡化；铁稳态相关蛋白TFR1和FTH1蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。结果表明，铁死亡参与NP诱导肝细胞损伤机制，为深入探究NP致病机理提供了参考。
  • 党参皂苷对跨H9N2 AIV感染肺微血管内皮侵袭细胞功能的影响
    乔畅, 刘翔, 冯波, 穆祥, 张涛, 董虹, 胡格, 张倩
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1800-1806. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.29
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    为探讨党参皂苷对H9N2亚型禽流感病毒（avian influenza virus, AIV）感染引起机体免疫抑制的调控作用，首先应用不同质量浓度（5、10、20 mg/L）党参皂苷孵育大鼠肺微血管内皮细胞（rat pulmonary microvascular endothelial cells, RPMECs）,采用RT-PCR和流式细胞术检测PD-L1表达水平变化，并以ELISA试剂盒检测上清液中TNF-α、IFN-γ、IL-10含量及空斑法检测上清液中H9N2 AIV的滴度。然后利用8μm孔径Transwell板建立RPMECs和T细胞共培养体系，以模仿循环T细胞跨过微血管迁移到病毒感染部位的过程。在Transwell上室中培养RPMECs,用H9N2 AIV接种RPMECs, 1 h后加入含20 mg/L党参皂苷的培养基，36 h后加入T细胞。作用8 h后，收集下室中的T细胞，用流式细胞仪检测CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例，用ELISA试剂盒检测上清液中IL-2、IFN-γ和Granzyme B的表达水平，流式细胞分选技术检测Perforin-1阳性T细胞的比例，MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测T细胞的增殖活性，Annexin V-FITC/PI对T细胞染色后用流式细胞仪检测凋亡细胞的百分比。结果显示，党参皂苷可显著降低H9N2 AIV感染诱导的RPMECs中PD-L1的表达水平、IL-10及TNF-α表达量，降低T细胞凋亡率，但可显著提高跨内皮迁移T细胞中IL-2、IFN-γ、Perforin-1和Granzyme B的表达量及T细胞的增殖活性。结果表明，党参皂苷可显著抑制RPMECs中H9N2 AIV诱导的PD-L1的表达，增强跨内皮细胞层迁移T细胞的抗病毒功能，有利于增强宿主对H9N2 AIV抵抗能力。
  • 黄芪多糖合生元对大肠杆菌性犊牛腹泻粪便评分和血清指标的影响
    陈俊, 薛晨曦, 刘梦林, 李心慰
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1807-1812. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.30
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    为探讨黄芪多糖合生元对大肠杆菌性犊牛腹泻粪便评分和血液指标的影响，本研究选择品种相同(荷斯坦),日龄相近(6～9日龄),体质量相近(44.56±5) kg的20头大肠杆菌性腹泻犊牛，使用单因素完全随机设计分为对照组和试验组。试验期10 d,试验期内对照组与试验组犊牛每天肌肉注射博落回注射液(1 mg/kg)+恩诺沙星注射液(20 mg/kg)进行治疗，试验组犊牛除正常治疗方案外每天在饲奶中添加20 g黄芪多糖合生元制剂。试验期内每天上午9:00采集各组犊牛粪便进行粪便评分，试验期结束采集颈静脉血进行血液相关指标的检测。结果表明，试验组比对照组腹泻率下降17%,但粪便评分无显著统计学差异；试验组比对照组免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白M(IgM)含量分别增加54.81%和60.40%(P<0.01),免疫球蛋白G(IgG)和白细胞介素-10(IL-10)含量分别增加50.89%和46.80%(P<0.05),而白细胞介素-6(IL-6)含量减少28.99%(P<0.05),白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量分别减少20.88%和37.10%(P<0.01);试验组D-乳酸(D-LA)和内毒素(LPS)比对照组分别降低47.46%和65.31%(P<0.01),二胺氧化酶(DAO)活性降低30%(P<0.01);试验组比对照组总超氧化物歧化酶(T-SOD)含量增加12.78%(P<0.05),过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性分别增加53.09%和60.57%(P<0.01),而丙二醛(MDA)含量降低33.29%(P<0.01)。结果表明，黄芪多糖合生元制剂可以缓解大肠杆菌性腹泻犊牛的肠黏膜损伤，提高机体免疫力并提升抗氧化应激能力，降低致病菌和氧化应激对肠黏膜通透性的影响。
  • 黄连解毒散对热应激条件下巴马香猪PBMC TLRs mRNA转录及其介导的炎症因子表达的影响
    董林, 王艳萍, 徐倩倩, 刘吉山, 王金良, 王化磊, 沈志强
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1813-1820. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.31
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    为探索黄连解毒散对热应激导致的动物机体免疫抑制和炎症反应的影响。以巴马香猪为实验动物，建立热应激动物模型，研究黄连解毒散体内条件下对热应激导致的PBMC中TLRs mRNA转录激活及其介导的炎症因子表达的影响。采用人工气候温室建立热应激动物模型，制备中药“黄连解毒散”,通过预防给药和治疗给药，研究其对热应激及其炎症的抑制效应。利用细胞分离培养和间接免疫等技术，实时荧光定量PCR测定HSP70、TLRs和IL-17 mRNA转录变化，ELISA定量测定血清中IL-2、IL-6、TNF-α含量动态变化，Western blot与间接免疫荧光(IFA)测定NF-κβ炎症因子通路中p65磷酸化蛋白核易位与蛋白表达，分析介导热应激条件下巴马香猪PBMC TLRs mRNA转录及其介导的炎症因子表达与效应功能，研究中药“黄连解毒散”抗热应激效应及其作用通路。结果显示，成功建立了热应激巴马香猪实验动物模型，热应激显著上调了HSP70、TLR2、TLR4和炎症因子IL-17 mRNA转录水平，导致血清中炎症因子IL-2、IL-6、TNF-α的表达显著性增强，显著促进NF-κβ通路中p65核内磷酸化水平和胞质蛋白表达。中药“黄连解毒散”可显著降低热应激条件对HSP70和TLRs mRNA转录水平的上调效应，从而抑制效应炎症因子IL-17mRNA转录和血清中IL-2、IL-6和TNF-α的表达，显著性拮抗热应激导致的NF-κβ转录活性，显示良好的抗热应激效应。结果表明，研究了中兽药方剂“黄连解毒散”抗炎效应和其作用通路及其效应因子，分析了其抑制TLRs mRNA相关联的通路调控相关因子的表达与分泌水平，对其对临床上抗热应激、抗炎的功能效应和作用机理进行初步探索，为该方剂的推广应用和相关机理研究奠定了数据基础。
  • 黄芪多糖合生元的制备及其对犊牛生长性能的影响
    王蓝卓, 薛晨曦, 陈俊, 李心慰, 刘国文
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1821-1830. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.32
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    首先使用冷冻干燥法制备黄芪多糖合生元粉剂，响应面法优化后的冻干保护剂配方为17.99%脱脂乳粉，7.26%蔗糖，8.04%低聚半乳糖和9.64%黄芪多糖，余量为蒸馏水；制备的菌粉中乳酸菌存活率为88.06%。随后进行犊牛饲喂试验评价黄芪多糖合生元的临床应用效果。试验选取30头日龄相近(2～4日龄)、健康的新生犊牛，将其随机分为对照组和黄芪多糖合生元饲喂组，每组15头，试验期为28 d。结果表明，与对照组相比，黄芪多糖合生元饲喂组犊牛平均日增重(ADG)显著增加，而且粪便评分和腹泻率也显著降低；与对照组相比，黄芪多糖合生元饲喂组犊牛血清IgA、IgG、IgM、IL-2和IL-10含量显著升高，而血清IL-6和TNF-α含量显著降低；对粪便进行微生物多样性分析，黄芪多糖合生元能够显著增加Chao1、Sobs和Shannon指数并显著降低Simpson指数；在门水平上，蓝藻菌门(Cyanobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度在黄芪多糖合生元饲喂组显著增加，而变形菌门(Proteobacteria)相对丰度显著减少；在属水平上，黄芪多糖合生元饲喂组的大肠杆菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)相对丰度显著降低，未命名梭菌纲＿UCG-014属(norank＿f＿＿norank＿o＿＿Clostridia＿UCG-014)和丁酸球菌属(Butyricicoccus)相对丰度显著增加。综上，本研究成功制备出黄芪多糖合生元粉剂，并证明该粉剂能够显著促进犊牛的生长，增强免疫机能，改善肠道菌群结构并减少犊牛腹泻的发生率。
  • 猪繁殖与呼吸综合征病毒天然免疫逃逸机制研究进展
    刘爱军, 黄晓兵, 章杭建, 周彩琴, 安慧婷, 张传亮
    中国兽医学报. 2024, 44(08): 1831-1840. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.08.33
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    天然免疫是抗病毒免疫反应的前线，也是适应性免疫的桥梁。猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)进化出多种策略逃逸宿主的天然免疫从而建立持续性感染，这是控制PRRSV感染的最大障碍之一。在抗病毒天然免疫中，Ⅰ型干扰素、干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes,ISGs)和其他抗病毒蛋白是主要的执行者，细胞自噬和细胞程序化死亡是重要的组成部分，非编码RNA是关键的调节因子。近年来PRRSV天然免疫逃逸的机制研究不断涌现，极大扩展了我们对PRRSV与宿主之间相互作用网络的理解。本文概述了PRRSV抑制Ⅰ型干扰素产生及其信号转导、拮抗ISGs和其他抗病毒蛋白的最新研究成果，并重点总结了PRRSV通过调控细胞自噬、细胞程序性死亡以及非编码RNA等逃逸天然免疫的研究进展，以期为后续研究及抗PRRSV疫苗和药物研发提供思路。
2025年, 第45卷, 第04期
刊出日期：2025-04-15
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