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2025年, 第45卷, 第03期 
刊出日期:2025-03-15
  

  • 全选
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  • 李红, 安瑞, 李驰欢, 朱思萍, 董玉来, 吴同垒, 史秋梅, 张志强
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 397-403. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.01
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    为建立牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)血清学检测方法,本试验对BPIV3的HN、NP、F、P蛋白进行原核表达、纯化,筛选最适蛋白包被抗原,建立间接ELISA检测方法。结果显示,成功表达了BPIV3的4种重组蛋白rHN、rNP、rF和rP;棋盘滴定结果显示,rHN蛋白作为包被蛋白具有最高的P/N值,因此用于后续方法建立。摸索间接ELISA的最适反应条件:抗原包被质量浓度为0.5 mg/L,37℃1.5 h; 5%脱脂牛奶,4℃过夜封闭;血清1∶50稀释,37℃孵育1 h;二抗稀释度为1∶10 000,37℃孵育0.5 h;底物反应条件为37℃12 min。特异性试验结果显示,所建立的方法能够特异性识别BPIV3抗体阳性血清,且灵敏度达到1∶800,批内与批间重复性的检测中变异系数均小于10%,与SVANOVIR试剂盒检测同一批样品的总符合率为92.22%。应用该方法对河北地区192份血清样品进行检测,血清中BPIV3抗体阳性率为66.15%。结果表明,本试验构建的BPIV3抗体间接ELISA检测方法适用于临床大规模血清学调查。
  • 朱晨曦, 黄向月, 朱庆, 丁露, 邓梏男, 阿克阿加, 贺春赛, 马元珍, 吴锦波, 张朝辉, 张斌
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 404-411+442. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.02
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    针对牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)的基质蛋白(M)和血凝素-神经氨酸酶(HN)基因进行密码子优化并构建重组穿梭质粒Dual-M+HN;使用杆状病毒表达系统制备BPIV3病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs),并采用Western blot、间接免疫荧光和电镜对其进行验证;将验证成功的VLPs与MF59佐剂和CpG-ODN免疫增强剂混合通过肌注方式免疫小鼠。通过检测小鼠血清特异性抗体、中和抗体和血凝抑制抗体来评估BPIV3 VLPs的免疫效果。结果显示,优化后的M和HN蛋白基因密码子适应指数(codon adaptation index, CAI)分别为0.96和0.95,CG含量分别达到54.1%和53.1%;构建的重组质粒转化至DH10Bac进行蓝白斑筛选,将验证正确的重组杆粒转染至Sf9细胞,获得杆状病毒pFastBac-M+HN,电镜下观察可见直径约180 nm的BPIV3 VLPs; IFA和Western blot试验均证明目的蛋白的成功表达并具有生物学活性;通过蛋白优化发现感染剂量MOI=5时蛋白表达量最高;将50μg VLPs与MF59佐剂和CpG-ODN混合后肌注方式免疫小鼠,结果显示VLPs免疫组在首免2周时抗体开始上升,在二免后21 d时达到最高,平均IgG抗体滴度为1∶40 228,中和抗体滴度平均为1∶298,血凝抑制抗体滴度为1∶549,达到灭活苗水平(P≥0.05),表明本试验制备的VLPs能诱导机体产生体液免疫反应。结果表明,本试验成功制备了能自组装表达BPIV3 HN和M蛋白的VLPs,并能诱导小鼠机体产生体液免疫反应,为后续BPIV3 VLPs疫苗研究奠定了基础。
  • 丁露, 黄向月, 吴锦波, 张朝辉, 朱庆, 朱晨曦, 邓梏男, 阿克阿加, 贺春赛, 马元珍, 张斌
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 412-419. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.03
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    针对牛纽布病毒(bovine nebovirus, BNeV) VP1基因进行密码子优化并构建重组质粒pFastBac-Dual-VP1,使用杆状病毒表达系统制备BNeV-VP1病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs)。采用Western blot、间接免疫荧光和电镜对其进行鉴定。将验证正确的VLPs与MF59佐剂、CpG-ODG免疫增强剂混合后免疫小鼠并评估其免疫效果。结果显示,优化后的VP1基因密码子适应指数(codon adaptation index, CAI)为0.93,GC含量为60.4%;将构建的重组质粒转化至DH10Bac进行蓝白斑筛选,验证成功后转染至SF9细胞,获得重组杆状病毒Baculo-BNeV-VP1;电镜下可观察到直径在35~40 nm的BNeV VLPs; IFA和Western blot试验均证明VP1蛋白可以成功表达并具有生物学活性;通过蛋白优化发现感染剂量MOI=0.5时蛋白表达量最高;将50μg VLPs与MF59佐剂和CpG-ODN混合后,以肌肉注射方式免疫小鼠,结果显示VLPs免疫组在首免后7 d产生IgG抗体,且抗体滴度逐步增加,于28 d达到峰值(1∶102 400),35 d时有所下降,但仍保持较高水平;阻断效价BT50最高为640,可诱导小鼠产生BNeV VP1特异性阻断抗体。结果表明,利用杆状病毒表达系统表达了BNeV的VP1蛋白,并成功构建了BNeV VLPs,其能诱导小鼠机体产生体液免疫反应,为后续BNeV疫苗研究提供了参考。
  • 蔡丙严, 乔洋洋, 刘天昕, 左伟勇, 王永娟, 张凯, 陆辉, 王海明
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 420-426. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.04
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    2018年6月黑龙江佳木斯某猪场的母猪出现了大量流产,随后该场的断奶仔猪在35日龄左右开始出现持续高烧症状,部分猪体温超过41.5℃。为确定此次疫情的病因,本研究对来自本养殖场送检的63份临床样品进行检测。结果显示,63份样品中有60份样品呈现猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)抗原阳性。随后将PRRSV抗原阳性病料接种于非洲绿猴胚胎肾细胞(Marc-145),盲传3代后,进行IFA(indirect immunofluorescence assay),结果显示,成功分离获得1株PRRSV,命名为HLJ38株。随后对HLJ38株进行了全基因组测序,并利用生物信息学软件对其基因组进行了详细分析,结果显示HLJ38株Nsp2基因的推导氨基酸序列中存在3处、共计131(323~433 aa、483 aa和504~522 aa)个氨基酸的缺失,符合类NADC30 PRRSV的分子遗传标志;进化树分析结果显示,HLJ38与GenBank中的类NADC30 PRRSV同属于谱系1亚群,与国内代表毒株CH-1a、HuN4亲缘关系较远,其核苷酸同源性仅为85.2%和84.6%;重组分析结果显示,HLJ38是1株重组的类NADC30 PRRSV,且重组的基因片段来源于多个毒株,其中1~201 nt片段由VR2332毒株提供,而6 641~8 061 nt来源于HP-PRRSV毒株。结果表明,该猪场此次疫情的原因可能是由不同谱系间PRRSV毒株发生重组所致,重组后的流行毒株不仅具有一定的致病性,而且现有的商品化疫苗对其交叉保护性较弱;不同谱系间的重组增加了PRRSV的基因多样性,也加剧了猪场PRRS防控的难度。因此,有必要持续监控猪场中PRRSV的流行动态,及时采取有效措施,遏制PRRS疫情的扩散。
  • 王新港, 郭占达, 杜季梅, 姬星宇, 张先锋, 陈陆, 王彦辉, 王川庆
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 427-435. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.05
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    为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒种1(porcine reproductive and respiratory syndrome virus 1,PRRSV1)在河南省的流行情况,本研究对河南省部分规模化猪场临床病料进行分子流行病学调查与病毒分离鉴定。利用PRRSV1 ORF5基因特异性引物进行RT-PCR检测与序列测定,结果共检测出PRRSV1阳性样品8份,获得ORF5基因序列6个,全基因序列1个。利用PAM细胞成功分离出1株PRRSV1,命名为HENZMD-10。对分离毒株基因遗传变异分析,获得的6个ORF5基因均为PRRSV1,分离毒株ORF5基因遗传变异较大,遗传进化树上分属于不同的分支。其中,HENJZ-11、HENJY-7、HENJY-8遗传进化距离较近,分属于同一分支。HENZMD-10分离株基因组全长为15 071 bp,核苷酸序列比对与LV毒株核苷酸相似性为89.1%;与PRRSV2 ATCC-VR2332毒株核苷酸相似性为62.1%;与美国NADC30毒株核苷酸相似性为61.5%;与国内JXA1毒株核苷酸相似性为61.6%。全基因组遗传进化分析显示,HENZMD-10与国内分离PRRSV1毒株NVDC-NM1-2011、LNEU12和FJEU13毒株的遗传距离较近。结果表明,本试验通过对河南省PRRSV1的分子流行病学调查以及病毒全基因遗传进化分析,成功分离1株PRRSV1,为PRRSV1在国内的流行动态及其防控提供一定的临床指导意义。
  • 李星雨, 李岩, 杨盼盼, 刘俊杰, 相梦佳, 朱玉涛, 邱路遥, 乔麒龙, 张伯顺, 卜德新, 韩城昊, 于春梅, 丛雁方, 王增, 李建丽, 王白玉, 赵军
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 443-448+513. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.07
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    为构建表达鹅星状病毒基因2型(GoAstV-2)衣壳蛋白(Cap)的重组禽腺病毒4型(FAdV-4),本研究将GoAstV-2的Cap基因表达盒插入到含有FAdV-4感染性克隆p15A-cm-FAdV4-HNJZ中FAdV4基因组的1 966 bp自然缺失区,将获得的重组感染性克隆p15A-cm-FAdV4-HNJZ-Cap/GoAstV-2利用限制性内切酶线性化后转染鸡肝癌细胞系(chicken hepatoma cell line, LMH),拯救出表达Cap蛋白的重组病毒rFAdV4-Cap/GoAstV-2。将重组病毒在LMH细胞中连续传至第15代,提取重组病毒基因组DNA,用插入位点两侧的鉴定引物进行PCR和利用抗Cap蛋白多克隆抗体进行间接免疫荧光试验和Western blot对重组病毒进行鉴定,同时对重组病毒在LMH细胞中的复制动态进行了研究。结果显示,GoAstV-2的Cap基因能够稳定存在于重组病毒rFAdV4-Cap/GoAstV-2基因组中,而且获得稳定表达;重组病毒具有良好的体外复制能力。本研究所制备的重组病毒rFAdV4-Cap/GoAstV-2为研制防控鹅FAdV-4和GoAstV-2混合感染的新型高效二联灭活疫苗奠定了基础。
  • 周桂仙, 吴诗卉, 王敏乐, 廖义潇, 李双, 杨泽敏, 杨颖
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 449-457. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.08
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    运用生物信息技术分析FliCEcN的结构和潜在的抗原表位;借助ClonExpress?同源重组技术设计引物,缺失FliCEcN高变区不同结构域,并克隆至pET-28a(+)表达载体中表达,经SDS-PAGE和Western blot鉴定鞭毛蛋白变体;采用鲎试剂显色法检测鞭毛蛋白变体中内毒素残留,并使用不同质量浓度的鞭毛蛋白变体刺激Caco-2细胞,通过检测IL-8的分泌水平来评估各鞭毛蛋白变体的生物学活性。生物信息分析结果显示,FliCEcN高变区的多数结构域被预测为含有潜在的抗原表位;PCR结果显示,fliC△820~1 518、fliC△736~963、fliC△985~1 200、fliC△748~828、fliC△1 114~1 191和fliC△1 225~1 311分别约为1 095、1 566、1 578、1 713、1 716、1 707 bp; SDS-PAGE结果显示,经镍柱纯化处理和透析复性的鞭毛蛋白变体分别约为41.36、57.06、57.50、61.97、61.95、61.56 kDa; Western blot结果显示,6个鞭毛蛋白变体均能与抗His单克隆抗体和大肠杆菌H7抗原诊断血清发生特异性反应;TLR5活性检测结果显示,缺失不同结构域的鞭毛蛋白变体保留了其TLR5激动剂功能。结果表明,本试验成功构建了6种FliCEcN缺失高变区不同结构域的鞭毛蛋白变体,且各鞭毛蛋白变体均保留了其TLR5激动剂功能,展现了良好的生物学特性,为进一步研究鞭毛蛋白在缺失不同结构域后的佐剂效应以及鞭毛蛋白抗体滴度对其佐剂效应影响提供了参考依据。
  • 章石楠, 韩生义, 石田, 李淑萍, 胡国元, 高瑞, 田嘉琪, 周雯雯, 李生庆
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 458-465+472. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.09
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    用生物信息学软件将本实验室分离的Escherichia coli QML2206-1(E.coli QML2206-1)株与不同菌种的外膜蛋白A(OmpA)蛋白氨基酸序列进行同源性分析,并对OmpA蛋白进行理化性质分析、跨膜结构和信号肽预测、B细胞抗原表位预测、二级和三级结构预测;将OmpA基因片段与pET-32a载体连接,构建原核表达载体,在BL21(DE3)进行原核表达并优化表达条件后用镍柱亲和纯化系统进行纯化;将纯化后的重组蛋白与弗氏佐剂充分混匀后免疫小鼠,利用ELISA方法检测小鼠特异性IgG抗体水平及小鼠血清中细胞因子CD4、CD8、IL-4的表达水平,并通过小鼠攻毒保护试验评价其免疫保护效果。结果显示,OmpA蛋白为亲水性蛋白,无跨膜结构域,二级结构主要由无规则卷曲(47.98%)和α-螺旋(29.77%)构成,有12个能与B细胞产生的抗体结合的抗原表位。经原核表达成功获得相对分子质量约为55 kDa的重组蛋白OmpA,且在37℃、IPTG浓度0.000 4 mol/L诱导6 h的表达量最高。重组蛋白免疫小鼠后血清特异性IgG抗体效价最高可达1∶32 000;与对照组相比,免疫小鼠血清中CD4、CD8及IL-4的表达水平均有升高。用最小致死量(minimum lethal dose, MLD)、2倍最小致死量(2MLD)攻毒后小鼠存活率分别为80%、40%。结果表明,OmpA重组蛋白具有良好的抗原性和一定的免疫保护作用。该研究为下一步基于OmpA蛋白的牦牛适用性E.coli基因工程亚单位疫苗的研制提供了技术依据。
  • 龙宥茨, 顾庆林, 鲜思美, 郑维豪, 吴琴, 余梦怡, 李京, 吴帅斌
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 466-472. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.10
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    根据GenBank上已公布的鸭源多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)kmt1基因序列,设计PCR扩增引物,将扩增所得kmt1基因克隆至pMD19-T载体中,构建重组质粒标准品pMD19-T-kmt1,并经PCR和测序鉴定。以pMD19-T-kmt1质粒为模板,kmt1基因为靶基因,设计并合成重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)引物;根据横向流动试纸条(lateral flow dipstick, LFD)要求设计1条探针(Pm-P),经反应条件优化,建立了检测Pm的RPA-LFD方法,并进行特异性、灵敏性试验,用所建方法对64份临床样品进行检测。结果显示:建立的Pm RPA-LFD方法在37℃15 min即可完成扩增反应;提取鸭源大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)、鸭源沙门菌(Salmonella enteriditis,SE)、鸭疫里默杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)、葡萄球菌(Staphylococcus)、鹅细小病毒(goose parvovirus, GPV)、鸭瘟病毒(duck plague virus, DPV)、番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus, MDPV)的DNA作为模板,以质粒标准品pMD19-T-kmt1为阳性对照进行RPA-LFD,显示除阳性对照外其他均为阴性;将质粒标准品pMD19-T-kmt1进行10倍倍比稀释,以浓度为10~7~100 拷贝/μL的质粒标准品为模板,检测出敏感度为1.50×10~1拷贝/μL,比PCR方法高100倍。利用PCR、RPA和LAMP-LFD检测64份疑似RA临床样本,3者检出符合率为100%。结果表明,本试验建立的Pm RPA-LFD方法具有特异性强、检测速度快、敏感度高等特点,可应用于Pm的临床样本检测。
  • 韦艳娜, 王吉英, 谢欢, 李志强, HASSAN Z.A.Ishag, 谢星, 徐彬, 熊祺琰, 冯志新, 邵国青, 于岩飞
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 473-481. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.11
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    采用pGEM?-T载体作为骨架,通过质粒双酶切和连接以及全基因合成的方法,向载体质粒中插入猪肺炎支原体(Mesomycoplasma hyopneumoniae,Mhp)的oriC序列,获得pGEM?-Mhp-oriC-p97重组穿梭质粒,以实现质粒在Mhp中的复制;插入螺原体启动子及嘌呤霉素抗性基因用于重组单克隆的筛选;插入p97的上、下游同源臂用于同源重组的启动;插入大肠杆菌recA基因用于提高同源重组效率。然后,将pGEM?-Mhp-oriC-p97重组穿梭质粒通过电转化或化学转化递送入Mhp中,利用嘌呤霉素抗性基因及p97目的基因进行基因缺失株的筛选。结果显示,构建了一种能够同时在Mhp及大肠杆菌中复制的穿梭质粒pGEM?-Mhp-oriC-p97,该质粒的转化能实现嘌呤霉素基因、recA基因在Mhp中的表达及p97基因的变异,初步获得了p97基因突变株。结果表明,建立了一种利用同源重组原理实现Mhp基因编辑的工具,为Mhp致病机制研究工具的开发奠定了基础。
  • 颜梦学, 叶静, 曹胜波, 熊俊垚
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 482-488. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.12
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    通过RT-PCR方法从基因Ⅰ型(GⅠ)日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)GX株中扩增覆盖全长cDNA的3段基因片段,将3个基因片段依次克隆到pBR322载体上以获得感染性克隆质粒pGX,测序正确后将该感染性克隆质粒与pCAGGS-T7 聚合酶真核表达质粒共转染至BHK-21细胞中进行病毒的拯救。间接免疫荧光和噬斑试验结果显示,成功拯救GⅠJEV rGX;噬斑试验和小鼠感染试验结果显示,拯救的病毒rGX与野生型病毒GX具有相似的复制能力与致病性。结果表明,成功构建了GⅠJEV GX毒株感染性克隆。
  • 李勇璠, 李尉晖, 颜权辉, 杜雯欣, 曹龙龙, 李佳康, 曾悦, 曹胜波, 李秋燕, 周登元
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 489-497. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.13
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    2022年12月至2023年12月期间,在全国采集2 560份拭子样品,利用PCR方法对猫博卡病毒(feline bocavirus, FBoV)进行检测并扩增其NS1及VP2基因编码序列;同时,利用生物信息学方法分析FBoV的遗传多样性。结果显示,FBoV的总阳性率为4.6%(119/2 560),共在8个省或直辖市的样品中检出FBoV,疾病呈区域性流行特点;基因遗传进化分析结果显示,FBoV以多种基因型存在,我国主要以FBoV-1型流行为主,本研究鉴定的15株FBoV-1型毒株、4株FBoV-2型毒株、1株FBoV-3型毒株与中国、美国、泰国、澳大利亚、葡萄牙所鉴定的毒株遗传距离较近;同源性分析结果显示,各测序毒株与参考毒株间NS1及VP2基因氨基酸同源性分别为60.40%~99.20%和67.20%~100%,各测序毒株之间NS1及VP2氨基酸同源性分别为60.60%~100%和67.80%~100%,结果表明,我国流行的FBoV毒株具有明显的遗传多样性。本研究为阐明我国FBoV的流行现状充实了资料,并为后续针对FBoV的诊断或防控提供了流行病学调查基础。
  • 宋奇珊, 宋智婕, 王晓乾, 赵敏, 李璐璐, 刘玉庆, 赵宇军
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 498-506. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.14
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    从污水中分离出1株沙门菌裂解性噬菌体PJN025,测定其生物学特性和全基因组序列,并评估其在动物感染模型中的治疗潜力。透射电镜观测结果显示,其属于Caudoviricetes科。PJN025仅裂解鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌,潜伏期约10 min,暴发期80 min,暴发量约为132 PFU/细胞,表明噬菌体能够高效杀菌;噬菌体的稳定性良好,在30~70℃之间和pH3~12范围内保持稳定。全基因组测序显示,该噬菌体基因组全长为46 478 bp, G+C含量为45.9%,包含82个开放阅读框和1个tRNA,未检测到已知的毒力基因或耐药基因。使用足部注射的方式对大蜡螟幼虫进行鼠伤寒沙门菌的攻毒,48 h时细菌攻毒的阳性对照组的存活率是5%,使用1×10~8 PFU/mL的PJN025噬菌体后,预防组的疗效最好,存活率可提高至70%;使用腹腔注射的方式对SPF小鼠进行鼠伤寒沙门菌的攻毒,5 d时细菌攻毒的阳性对照组中的小鼠全部死亡,使用1×10~8 PFU/mL的PJN025噬菌体后,共感染组的疗效最好,存活率可提高至60%,表明噬菌体的使用能够提高受试动物的存活率。结果表明,噬菌体PJN025特异性强、裂解效率高、对酸碱耐受性较好、耐热性强,安全性和预防效果好,为后续噬菌体产品的研制提供了材料和实验基础。
  • 董炳梅, 梁萌萌, 许文雅, 王君, 宋立立, 任洪林
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 507-513. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.15
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    为了探明巨噬细胞(macrophage, Mφ)感染布鲁菌(Brucella)后泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin proteasome system, UPS)和自噬-溶酶体途径(autophagy-lysosome pathway, ALP)在对抗Brucella过程中的相互作用关系,一方面将猪种布鲁菌(Brucella suis,B.suis)分别体外感染Mφ和腹腔接种BALB/c小鼠,并对细胞上清液和腹腔液中LC3Ⅱ、P62与20S蛋白酶体水平进行了测定,结果显示B.suis感染过程中UPS首先被激活,随后ALP途径发挥作用;另一方面,应用3-MA、乳胞素分别制备ALP抑制态Mφ与UPS抑制态Mφ并接种B.suis,随后对细胞上清中LC3Ⅱ、P62与20S蛋白酶体水平进行测定,结果显示当MφUPS功能被抑制时,ALP作用被显著提高;而ALP功能被抑制时,UPS活性未有显著变化。最后,将不同状态Mφ接种B.suis后,对B.suis的胞内增殖能力进行测定,结果显示当UPS与ALP功能被同时抑制时,B.suis的胞内增殖能力显著降低,且UPS对B.suis胞内增殖的促进作用强于ALP。结果表明,Brucella感染Mφ过程中UPS与ALP存在相互作用关系,在理论上可为Brucella与宿主细胞相互作用机制的研究提供新思路。
  • 吴小霞, 丁静, 金雪敏, 张壮志, 张藜潇, 刘明远
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 519-526. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.17
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    收集免疫反应较强的中间宿主羊细粒棘球绦虫感染阳性血清,以健康血清为阴性对照,纯化该血清与靶标蛋白经免疫沉淀捕获和富集相应的抗原,获得靶标蛋白-抗体-目的蛋白复合物。联合质谱策略筛选与鉴定细粒棘球绦虫相关特异性抗原,利用在线预测软件对肽段覆盖率最高的蛋白进行生物信息学分析。结果显示,IP-MS鉴定得到133种细粒棘球绦虫相关蛋白,其中肽段覆盖率≥70%的有1种蛋白,为肌动蛋白;肽段覆盖率为30%~40%的有3种蛋白,分别为含Ton B结构域蛋白、NADH脱氢酶(泛醌)1 α亚复合物2、乳酸脱氢酶;肽段覆盖率为20%~30%的有6种蛋白,分别为剪接因子3b亚基5、肿瘤蛋白D52、表达的保守蛋白、NADH脱氢酶(泛醌)1α亚复合物7、肌苷-5′-单磷酸脱氢酶和醛酮还原酶家族1成员B4。生物信息学分析显示,肌动蛋白无信号肽,可能为非分泌型蛋白,亚细胞定位在细胞骨架,存在6个最佳潜在抗原表位,二级结构和三级结构一致以α螺旋和无规则卷曲为主。结果表明,免疫沉淀-质普联用技术是筛选和鉴定细粒棘球绦虫抗原的一种高通量、简便、快速有效的方法,可为筛选中间宿主羊血清诊断标识的特异分子及包虫病新型诊断技术的研发提供依据。
  • 陈海燕, 卢慧芳, 曹智高, 孙攀峰, 刘守铉, 宋超
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 527-534+593. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.18
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    基于核因子E2相关因子2(Nrf2)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路研究槲皮素抑制玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)诱导IPEC-J2猪小肠上皮细胞铁死亡的作用机制。体外培养IPEC-J2细胞,ZEN处理(25mg/L)的同时给予不同浓度槲皮素干预(10、20、40μmol/L)。生化法检测各组细胞培养液上清中乳酸脱氢酶(LDH)、总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)水平;荧光探针检测细胞中Fe2+、活性氧(ROS)和脂质过氧化水平;Western blot检测Nrf2、长链酯酰辅酶A合成酶4(ACSL4)和GPX4蛋白表达水平。将IPEC-J2细胞分为对照组、ZEN组、槲皮素组和ML385(Nrf2抑制剂)+槲皮素组,除对照组外其余各组均接受ZEN处理,并采用槲皮素和ML385进行干预,检测Nrf2/GPX4通路相关蛋白表达和铁死亡指标(LDH、Fe2+、MDA和GSH)变化。结果显示,与对照组比较,ZEN组细胞存活率、T-AOC及GSH、SOD水平、Nrf2和GPX4蛋白表达降低(P<0.05),细胞LDH释放率、Fe2+及ROS、脂质过氧化、MDA水平及ACSL4蛋白表达升高(P<0.05)。与ZEN组比较,槲皮素组细胞存活率、细胞T-AOC、SOD及GSH水平、Nrf2和GPX4蛋白表达升高(P<0.05),细胞LDH释放率、Fe2+及ROS、脂质过氧化、MDA水平及ACSL4蛋白表达降低(P<0.05)。与槲皮素组比较,ML385+槲皮素组细胞Nrf2及GPX4蛋白表达和GSH水平降低(P<0.05),细胞LDH释放率、Fe2+及MDA水平升高(P<0.05)。综上,槲皮素能够抑制ZEN诱导的IPEC-J2细胞铁死亡,其作用机制可能与其激活Nrf2/GPX4信号通路有关。
  • 江少佳, 南沙, 王慧康, 毛玲, 尹瑞玲, 雷蔷会, 王浩龙, 李好, 萧锦瑜, 丁明星, 丁一
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 535-541. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.19
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    首先采用原核表达制备氨基末端C型钠尿肽原(NT-proCNP)并对新西兰大白兔进行免疫。当兔血清效价达到预期后,提取其脾细胞总RNA,并反转录为cDNA。以cDNA为模板,利用简并引物分别对兔源抗体轻链可变区(VL)以及重链可变区(VH)基因进行扩增。通过重叠延伸PCR法将VL和VH拼接成完整的噬菌体单链抗体(scFv)片段,再将scFv与嗜菌粒pComb3XSS连接并电转化至感受态E.coli TG1中以构建抗NT-proCNP兔源单链抗体免疫文库。对该抗体库进行4轮富集淘筛,并从中筛选出特异性单链抗体。最后通过原核表达系统对单链抗体进行可溶性表达并检测其免疫反应活性。结果表明,本研究基于噬菌体展示技术成功筛选到1株具有良好抗原结合活性且符合scFv基因特征的单链抗体scFv-1-CNP,为进一步探究单链抗体在NT-proCNP检测中的应用提供了研究思路。
  • 张玉蝶, 刘冰, 刘冬禹, 郭巾玲, 吴丛梅, 殷玉和
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 542-548+610. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.20
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    将金属硫蛋白3 (MT-3)基因序列与破伤风毒素C片段(HC)基因序列通过连接子进行融合,构建pET30a-MT-3-HC重组质粒,转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,重组质粒经双酶切鉴定。诱导M3C重组蛋白表达,经SDS-PAGE和Western blot鉴定,Ni-NTA亲和层析纯化。将PBS、HC、TT(破伤风类毒素)、M3C、M3C+CpG(复合佐剂) 5组疫苗肌肉注射小鼠,每隔7 d进行1次免疫,共3次,定期从尾静脉采集血样。采用ELISA法测定血清中特异性IgG抗体滴度的变化,并在第28天测定抗体分型(IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM)和细胞因子(IL-4、IFN-γ)水平。结果显示,pET30a-MT-3-HC重组质粒构建成功,超声破碎诱导的细菌培养上清液中M3C重组蛋白高表达,纯化后观察到单条带;ELISA结果显示,M3C+CpG组特异性IgG抗体滴度在第3次免疫后14 d达到峰值,为3.54×10~5,分别是HC组、TT组和TT组的141、70和6.6倍;抗体分型分析显示,与PBS、HC和TT组相比,M3C组和M3C+CpG组特异性抗体分型滴度显著升高(P<0.05),其中M3C组IgG1/IgG2a比值大于1,而M3C+CpG组IgG1/IgG2a比值约为1;M3C组和M3C+CpG组血清中IFN-γ和IL-4浓度也显著高于其他试验组(P<0.05)。结果表明,含有MT-3内置佐剂和破伤风毒素C片段的抗原成功表达,并表现出较强的免疫原性,为这种重组疫苗的研制奠定了试验基础。
  • 张世佳, 张琼一, 崔婵婵, 陈美琳, 王霄, 刘海涛, 刘欣, 史万玉, 包永占
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 549-558. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.21
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    375只体况一致、体质量均匀的1日龄AA肉鸡随机分为5组,每组5个重复,每个重复15只鸡。试验分别设置空白对照组(CON组,饲喂基础日粮)、低剂量槐花槐角粗提物(crude extract of Flos sophorae and Fructus sophorae,FS)组(FSL组,基础日粮中添加100 mg/kg FS)、中剂量FS组(FSM组,基础日粮中添加150 mg/kg FS)、高剂量FS组(FSH组,基础日粮中添加200 mg/kg FS)和博落回(Macleaya cordata,MC)组(基础日粮中添加300 mg/kg博落回散),试验期为42 d。检测肠道消化酶活性、肠道形态、肠道组织抗氧化和免疫能力以及屏障防御功能,并分析肠道微生物群落结构和多样性。结果显示,与CON组和MC组相比,FSH组可显著提高十二指肠、空肠和回肠胰蛋白酶活性(P<0.05);与CON组相比,FSM组和MC组可显著降低空肠组织活性氧、丙二醛含量,提升谷胱甘肽过氧化物酶活性,降低空肠组织肿瘤坏死因子-α含量,增高白介素-10含量,提高空肠黏膜闭合连接蛋白-1和黏蛋白-2 mRNA相对表达水平(P<0.05);微生物多样性显示,与CON组相比,FSH组显著提高了香浓指数(P<0.05),提高了厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)相对丰度,降低了变形菌门(Proteobacteria)相对丰度;有颤螺菌属(Oscillospira)、真杆菌属(Eubacterium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)等多种有益菌,肠道菌群结构更具有多样性且有益菌丰度更大。结果表明,饲料中添加200 mg/kg FS能够改善肉鸡肠道形态,增强肠道功能,巩固肠道健康,进而提高养殖效益。
  • 曲韵琦, 姜盛铭, 冯硕, 王晨颖, 赖思越, 马琪
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 559-567. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.22
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    将24只雄性SD大鼠随机分为4组,分别为空白组、模型组、白头翁汤(Pulsatilla decoction, PD)组和自愈组。除空白组外,其余各组大鼠采用“高糖高脂+高温高湿+大肠杆菌攻毒”诱导建立湿热泄泻(damp-heat diarrhea, DHD)大鼠模型,并以白头翁汤灌胃治疗。通过记录观察大鼠体质量、体温及采食饮水量变化,检测血常规指标,观察结肠组织病理学变化,综合判定DHD大鼠造模情况;通过观察大鼠海马区组织病理学变化,采用实时荧光定量PCR测定海马区IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ和TPH1 mRNA表达量,利用Western blot和免疫组化检测海马区中5-HT信号通路色氨酸羟化酶1(TPH1)、受体(5-HT3R、5-HT4R、5-HT7R)的蛋白表达情况。结果显示:模型组大鼠PD大鼠体质量、采食饮水量下降,血常规指标异常变化,结肠组织损伤,PD可回调异常变化,改善结肠组织病理损伤;PD显著降低DHD大鼠海马区炎症细胞因子IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α mRNA表达量(P<0.05),降低DHD大鼠海马区TPH1mRNA表达量(P<0.05);PD能升高5-HT4R和5-HT7R在DHD大鼠脑海马区的表达;降低5-HT3R、 TPH在脑海马区的表达,其中5-HT3R表达降低显著。结果表明,PD可通过调节5-HT信号通路影响DHD大鼠海马区功能。
  • 冯硕, 张丽芳, 谢雨霏, 姜盛铭, 曹立亭, 毕师诚, 马琪
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 568-579. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.23
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    选用24只断奶仔猪随机分为空白组、模型组、自愈组、白头翁散(Pulsatilla powder, PP)组,以“外邪+内伤+疫毒”复合因素建立仔猪泄泻模型,并用PP治疗。造模期间,每日监测仔猪体质量、精神状态及粪便形态。试验结束后,采集结肠进行组织病理学观察及通过ELISA检测结肠组织炎症因子IL-1β、IL-6含量,16S rRNA分析结肠肠道菌群,RT-qPCR法测定结肠色氨酸代谢相关基因。结果显示,与模型组相比,PP能明显改善泄泻仔猪结肠病理状态,杯状细胞显著增多(P<0.05);显著降低泄泻仔猪结肠IL-1β、IL-6含量(P<0.05)。肠道菌群结果显示,PP升高了厚壁菌门(Firmicutes,P<0.01)、螺旋体门(Spirochaetota,P<0.01)和乳酸杆菌属(Lactobacillus,P<0.05)的丰度,降低了拟杆菌门(Bacteroidota,P<0.05)、普雷沃菌属(Prevotellaceae_NK3B31_group,P<0.05)和梭菌属(Clostridium_sensu_stricto_1,P<0.01)的丰度。同时,PP显著降低了泄泻仔猪结肠TPH1 mRNA表达水平(P<0.05),升高了AhR(P<0.05)、IL-22 mRNA表达水平。结果表明,PP可能通过调节结肠肠道菌群及肠道色氨酸代谢相关基因缓解仔猪泄泻,为后续探究仔猪泄泻病证防治提供数据支持。
  • 胡雪勤, 樊长健, 何崎彪, 刘佩仪, 贺丹丹, 吴华, 马小元, 胡功政, 翟亚军
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 580-586. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.24
    摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏
    用微量肉汤稀释法测定紫杉醇(paclitaxel, PTX)单药、PTX+抗菌药联合用药对大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)临床分离株的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC),然后用棋盘试验测定PTX与黏菌素(colistin, COL)联合用药的部分抑菌浓度指数(FICI),通过建立小鼠腹腔感染模型,以小鼠的存活率和细菌载量来评估2种药联合的体内治疗效果,并进一步通过测定细胞膜通透性和外排泵活性,探究PTX与COL联用后的抑菌增效机制。MIC检测结果显示,PTX单药对E.coli(G5、E25)的MIC均>1 024 mg/L,对S.aureus S238的MIC为512 mg/L;PTX分别与10种抗菌药联用后,可显著增强COL对E.coli的抑菌活性(COL MIC值从4 mg/L和8 mg/L降低至1 mg/L)。棋盘试验结果显示,PTX与COL联合用药对E.coli(G5、E25)的FICI值分别为0.31、0.29,表现出协同抑菌作用;对E.coli G21、S.aureus(S237和S238)的FICI值分别为0.51、0.75和0.53,表现出相加作用。在小鼠腹腔感染模型中,与PTX或COL单药组相比,PTX与COL联合组能显著提高小鼠7 d存活率,并且能极显著降低小鼠肝、脾部E.coli的载菌量(P<0.001)。细胞膜通透性和外排泵活性结果显示,与PTX和COL单药相比,PTX与COL联合用药后可显著增加E.coli(G5和E25)的内膜和外膜的通透性,并且可显著抑制菌株的外排泵活性(P<0.01)。结果表明,PTX与COL联合用药后可通过增加细菌胞膜通透性和抑制外排泵活性而对COL耐药E.coli产生协同体内外抑菌增效作用。本试验为开发新型联合用药方案防控多重耐药性(multi-drug resistance, MDR)E.coli感染提供了理论依据。
  • 李童, 孔丽娟, 冯艳丽, 成基, 鞠天缘, 韩佳雯, 付守鹏, 柳巨雄, 胡桂秋, 张昊龙
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 587-593. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.25
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    将40只成年雄性C57BL/6小鼠随机分为4组(10只/组),分别为对照组、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium,S.typhimurium)组(ST组)、根皮苷(phlorizin, PHZ)+S.typhimurium组(PHZ+ST组)、PHZ组(80 mg/kg),通过形态学观察、HE染色、ELISA、免疫荧光和Western blot方法进行相关指标检测。结果显示,PHZ能够显著增加S.typhimurium诱导的小鼠盲肠指数,而降低小鼠的脾脏指数(P<0.05),并减少小鼠盲肠病理损伤。同时,PHZ也能够显著减少S.typhimurium在盲肠、脾脏、肠系膜淋巴结和肝脏中的定植(P<0.05)。通过ELISA检测S.typhimurium诱导的小鼠盲肠炎性因子的变化,结果显示PHZ也能够显著抑制由S.typhimurium诱导的IL-1β、INF-γ、TNF-α以及IL-6表达的升高(P<0.05)。免疫荧光和Western blot结果显示,PHZ能够显著增加S.typhimurium诱导的小鼠盲肠屏障Occludin、Claudin-3和ZO-1蛋白表达水平(P<0.05)。结果表明,根皮苷能够改善S.typhimurium感染引起的小鼠盲肠炎症以及肠道屏障受损。
  • 伊雪燕, 周润雨, 殷鹤予, 顾宇华, 匡华丽, 李蕴玉, 贾青辉, 李佩国
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 594-601. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.26
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    为了确定种鸡肿瘤病致死的病原,采集病死鸡的肝脏、脾脏等组织,运用PCR进行病原检测、测序及遗传进化分析。结果显示:3个样品网状内皮组织增殖病病毒(reticuloendotheliosis virus, REV)均为阴性,1、2号样品为禽白血病病毒(avian leukosis virus J,ALV-J)阳性,3号样品为ALV-J和马立克病病毒(Marek's disease virus, MDV)阳性,初步确定种鸡死于ALV-J感染或ALV-J和MDV混合感染。其中,ALV-J gp85基因与J亚群参考毒株核苷酸同源性最高,为87.70%~99.30%,并与J亚群参考毒株处于同一分支;氨基酸同源性为78.00%~96.20%,存在一定突变。MDV meq基因与特超强毒株(vv+)的核苷酸同源性最高,为98.00%~99.00%,与特超强毒株型(vv+)参考毒株处于同一分支;氨基酸同源性为95.90%~98.20%,且有多个突变位点,其中第176位氨基酸由Pro突变为Arg或Ala,破坏了病毒MDV meq原有的Pro重复序列,从而可能导致其毒力增强。本试验为该地区种鸡肿瘤性疫病的防控提供了参考。
  • 季子崴, 李思瑶, 张海鑫, 李紫薇, 张上明珠, 杨威, 徐闯, 张冰冰
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 602-610. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.27
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    采集健康、酮病奶牛外周血液并分离出CD4+ T细胞,Western blot检测脂质合成相关蛋白脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FASN)、乙酰辅酶A羧化酶1(acetyl coenzyme A carboxylase 1,ACC1)、白细胞分化抗原36(cluster of differentiation 36,CD36)及钙库操纵性钙离子内流(store-operated calcium entry, SOCE)相关蛋白ORAIl、ORAI2、ORAI3、STIM1、STIM2表达;流式细胞术检测IL-17表达。从1日龄犊牛脾脏分离CD4+ T细胞用于体外培养,细胞处理分为阴性对照siRNA处理组(Ctrl组)、沉默CD36(siCD36)组、硬脂酸(stearic acid, SA)组、SA+siCD36组。使用75 pmol/L阴性对照siRNA转染Ctrl组和SA组细胞48 h,然后用200μmol/L SA刺激SA组细胞24 h;使用75 pmol/L CD36 siRNA转染siCD36组和SA+siCD36组细胞48 h,然后用200μmol/L SA刺激SA+siCD36组细胞24 h。Western blot检测FASN、ACC1、CD36、钙释放激活钙调节因子1(calucium release-activated calcium channel protein 1,CRCM1,也称ORAI1),ORAI2、ORAI3、基质相互作用分子1(slromal interaction molecule 1,STIM1)、STIM2蛋白表达;流式细胞术检测IL-17表达。结果显示,与健康奶牛相比,酮病奶牛外周血CD4+ T细胞中IL-17表达显著升高(P<0.01);并上调了FASN、CD36、STIM1(P<0.05)及ACC1、ORAI2、ORAI3、STIM2的蛋白水平(P<0.01)。体外试验结果显示,相比于Ctrl组,SA组上调了CD36、ACC1、ORAI3(P<0.05)以及FASN、STIM1的蛋白表达(P<0.01),IL-17表达显著升高(P<0.05);相比于SA组,SA+siCD36组下调了STIM1、ORAI1(P<0.05)及CD36、ACC1、FASN、ORAI2的蛋白表达(P<0.01),IL-17表达降低(P<0.05)。结果表明,SA通过CD36促进酮病奶牛CD4+T细胞脂质合成并激活SOCE通道,促进IL-17表达。
  • 叶丹妮, 邓玲聪, 艾雪言, 董雨, 俞佳钰, 郝嘉翼, 李明玉, 陈文聪, 陈嘉豪, 王子仪, 白杰英, 王茂鹏
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 611-618. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.28
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    在日粮中添加植物乳杆菌LP12进行饲喂,观察并测定日本大耳兔的体质量增长和采食量情况,分析兔血液生化指标,以及血清和肝脏的抗氧化指标;通过16S测序分析菌群结构和丰度变化。结果显示,植物乳杆菌LP12能够显著抑制兔体质量增长,降低血清葡萄糖和谷丙转氨酶水平,增加肝脏的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活力。16S菌群结构分析显示,在门水平,添加植物乳杆菌LP12能够增加拟杆菌门和脱硫杆菌门丰度;在属水平,添加植物乳杆菌LP12能够增加Muribaculaceae菌丰度。菌群功能预测分析发现,添加植物乳杆菌LP12对铁-硫簇和Zn依赖性蛋白酶具有正向调节作用。结果表明,添加植物乳杆菌能够抑制日本大耳兔体质量增加,增加肝脏抗氧化活性,且能够改变日本大耳兔的肠道菌群结构。
  • 李阳, 樊爱丽, 陈吉林, 董丽娜, 左宗辉, 马淑慧, 徐刚
    中国兽医学报. 2025, 45(03): 619-626. https://doi.org/10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.03.29
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    禽传染性支气管炎(infectious bronchitis, IB)是由禽传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)引起鸡的一种急性、高度接触性传染病,IBV变异程度高,现有的免疫手段常无法达到良好的效果,严重影响国内养禽业的发展。通过对IBV的非特异性免疫、黏膜免疫以及特异性免疫等3个方面现阶段免疫应答分子机制的综述,以期为IBV免疫机制的研究提供理论参考。