为了研究贵州毕节某奶牛场荷斯坦奶牛发生腹泻的原因，从该奶牛场采集50份新鲜粪便样本，通过平板划线法对大肠杆菌进行分离纯化和PCR鉴定，采用K-B纸片法进行药物敏感试验，并对多种耐药基因进行PCR检测。针对多重耐药菌，选取虎耳草和杜鹃花2种中草药进行体外抑菌效果研究。结果显示：从腹泻奶牛粪便中分离出31株细菌，其菌落形态和生化特性与大肠杆菌相符；16S rRNA基因测序比对发现该牛场分离的菌株与NCBI数据库中大肠杆菌参考菌株的同源性达到99.65%～99.86%,确定该奶牛场的腹泻病原为大肠杆菌；药敏试验发现该牛场来源的大肠杆菌对多种抗生素(强力霉素、红霉素、青霉素G和四环素)耐药，而对磺胺异恶唑、头孢曲松、环丙沙星、庆大霉素、多黏菌素B、磷霉素等10种抗生素敏感；PCR扩增相关耐药基因发现，导致该牛场腹泻的大肠杆菌携带2种β-内酰胺类(bla_(CTX-M)、bla_(TEM)),4种四环素类(TetD、TetB、TetK、TetD、TetA),2种氨基糖苷类(ant(3″)-Ia、rmtB)和3种喹诺酮类(qnrS、qepA、oqxA)耐药基因。体外抑菌研究发现，杜鹃花(3.125 mg/mL)的水提物有显著的抑菌效果。试验结果可为该奶牛场防治大肠杆菌性腹泻提供用药指导，同时为开发替抗中草药产品提供了依据。