2023年, 第46卷, 第03期　
刊出日期：2023-05-15

  

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  神经介素B及其受体在不同发育阶段山羊睾丸组织中差异表达的研究

  夏荣欣, 李悦, 刘婷婷, 孙宣, 钟黄欣, 郭文晴, 曾诚, 张国敏

  南京农业大学学报. 2023, 46(03): 1-10.

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  [目的]本实验旨在探究神经介素B（neuromedin B， NMB）及其受体[神经介素B受体（neuromedin B receptor， NMBR）、胃泌素释放肽受体（gastrin releasing peptide receptor， GRPR）和蛙皮素受体（bombesin receptor subtype 3， BRS3）]在山羊不同发育阶段睾丸组织中的差异表达，为解析哺乳动物睾丸发育及功能调节的机制提供参考。[方法]选取系谱清晰和体况良好的雄性山羊12只（3和9月龄，各6只）进行阉割并采集睾丸组织，在NMB及其受体基因克隆与序列分析的基础上，采用免疫组化技术检测NMB及其受体在睾丸组织中的表达定位，利用RT-qPCR和western blot检测NMB及其受体在不同发育阶段山羊睾丸组织中的表达变化。[结果]NMB及其受体基因与绵羊和牛的进化关系最近，NMB及其受体基因编码区的核苷酸序列与牛和绵羊的同源性达96%以上，结构分析发现NMBR、GRPR和BRS3均属于七次跨膜受体。NMB及其受体在3月龄和9月龄山羊睾丸组织中广泛表达，其中在间质细胞、肌样细胞和精子细胞中呈高表达。与3月龄山羊相比，9月龄山羊睾丸组织中NMB与GRPR的mRNA和蛋白表达量显著降低（P<0.05），而NMBR与BRS3的mRNA和蛋白表达量显著增高（P<0.05）。[结论]NMB及其受体可能参与山羊睾丸发育的调节，丰富了家畜生殖生理学的研究。
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  水稻抽穗期基因OsFKF1的克隆和互作蛋白筛选

  闫晓峰, 胡渊, 黄晓龙, 金涛, 李海申, 田云录, 江玲, 周时荣, 万建民

  南京农业大学学报. 2023, 46(03): 429-437.

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  [目的]本文旨在探究水稻抽穗期基因OsFKF1(Rice FLAVIN-BINDING,KELCH REPEAT,F-BOX 1)感受蓝光并调控抽穗期的分子机制。[方法]以‘宁粳2号’及其晚抽穗突变体lhn2和lhn3为材料，分析野生型和突变体的农艺性状。利用MutMap的方法定位并克隆导致lhn2和lhn3突变的基因，研究候选基因OsFKF1的功能及水稻原生质体中OsFKF1的亚细胞定位。利用不同波长光源处理检测OsFKF1对Ehd1表达的影响。通过酵母文库筛选试验寻找与OsFKF1互作的蛋白，并利用荧光素酶互补等试验进行验证。[结果]在南京自然长日照条件下lhn2和lhn3突变体抽穗期较野生型均延迟26、27 d,株高、粒长、粒宽、千粒重均显著下降。MutMap分析结果表明导致lhn2和lhn3突变的基因均为水稻抽穗期基因OsFKF1。亚细胞定位结果显示OsFKF1在水稻原生质体中定位于细胞质和细胞核内。OsFKF1仅在蓝光下诱导Ehd1表达，且蓝光处理3 h达到峰值。利用酵母文库筛选试验筛到与OsFKF1互作的一个含有泛素结合相关结构域的蛋白HGW(HEADING AND GRAIN WEIGHT),荧光素酶互补试验结果证实OsFKF1与HGW互作。[结论]蓝光诱导Ehd1的表达部分依赖于OsFKF1。推测OsFKF1和HGW可能形成复合体，通过泛素化降解蛋白途径调控水稻抽穗。
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  不同滴灌模式对玉米生理特性的影响

  徐晨, 李前, 于江, 赵洪祥, 闫伟平, 孙宁, 张治安, 张丽华, 边少锋

  南京农业大学学报. 2023, 46(03): 438-446.

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  [目的]本研究旨在探寻玉米对不同滴灌模式的生理响应机制，寻求滴灌方式与滴灌定额之间的优化方案，为半干旱区玉米节水高效生产提供理论依据。[方法]利用可移动式防雨棚进行2年的小区试验，以玉米品种‘富民985’为试验材料，设置地上滴灌与浅埋滴灌2种滴灌方式，玉米全生育期300、400和500 mm 3个滴灌定额，即地上滴灌-300 mm(T1)、地上滴灌-400 mm(T2)、地上滴灌-500 mm(T3)、浅埋滴灌-300 mm(T4)、浅埋滴灌-400 mm(T5)和浅埋滴灌-500 mm(T6)6个处理，研究不同滴灌模式对玉米光合特性、叶绿素荧光特性、叶片氮代谢酶活性及根系伤流强度的影响。[结果]与T1、T2和T4处理相比，T3、T5和T6处理玉米大喇叭口期(V12)、吐丝期(R1)和灌浆期(R3)叶片的净光合速率(P_n)、气孔导度(G_s)、胞间二氧化碳浓度(C_i)、蒸腾速率(T_r)、水分利用效率(WUE)、表观叶肉导度(AMC)、光系统Ⅱ最大光合效率(F_v/F_m)、光系统Ⅱ实际光合效率(Φ_(PSⅡ))、电子传递效率(ETR)、光化学淬灭系数(qP)增加，气孔限制百分率(L_s)和非光化学猝灭系数(NPQ)下降。不同滴灌模式条件下，T3、T5和T6处理玉米叶片的谷氨酰胺合成酶(GS)活性、根系伤流强度均呈增加趋势，且显著高于T1、T2和T4处理，但谷氨酸脱氢酶(GDH)活性呈下降趋势。[结论]采用浅埋滴灌-全生育期400 mm滴灌定额(T5处理)的滴灌模式的玉米在根系伤流强度、叶片氮代谢酶活性、光合特性、叶绿素荧光特性等方面均表现较佳，获得了节水与高产的双重目的。
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  不同红蓝光比例对马铃薯块茎形成与产量的影响

  林佳婷, 陈松, 徐志刚

  南京农业大学学报. 2023, 46(03): 447-453.

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  [目的]本文旨在明确不同红蓝光比例对块茎形成期马铃薯植株匍匐茎的发生、块茎形成以及产量的影响。[方法]以马铃薯品种‘费乌瑞它’为材料，分别设置白光(W)、红光∶蓝光=1∶7(1R7B)、红光∶蓝光=1∶1(1R1B)和红光∶蓝光=7∶1(7R1B)4个光谱处理，测定不同光处理22、25、32、40和90 d的马铃薯植株匍匐茎数、块茎数、叶片中蔗糖和淀粉含量、植株生物量等参数，探究块茎形成期叶片糖代谢与匍匐茎、块茎形成的变化关系以及块茎成熟期叶片光合速率与光合产物代谢对产量的影响。[结果]与红蓝组合光谱相比，W处理显著提高了块茎形成期匍匐茎成薯率以及块茎成熟期叶片的光合速率、植株干重和收获指数，但降低了单株块茎数和商品薯率。1R7B光谱处理下叶片光合速率、植株干重、收获指数、块茎产量、平均块茎质量与商品薯率均降低。1R1B光谱处理有利于块茎成熟期叶片在光下合成的淀粉在黑暗条件下有效输送到库器官，提高了收获的块茎数量与块茎产量。与其他光谱处理相比，7R1B光谱处理有利于块茎形成期匍匐茎的发生与块茎的形成，提高了植株的商品薯率。[结论]高比例红光光谱(7R1B光谱和1R1B光谱)有利于马铃薯植株匍匐茎的发生与块茎的形成，白光有利于块茎的充实和产量的提高。生产上块茎形成阶段可采用提高红光比例促进块茎形成，块茎膨大充实阶段采用白光保障块茎充实的光照，提高马铃薯生产效率。
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  油菜苔和常见蔬菜ICP-MS离子组分分析与评价

  康金涛, 刘昆鹏, 杨闯, 全成滔, 戴成, 马朝芝

  南京农业大学学报. 2023, 46(03): 454-463.

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  [目的]本文旨在研究油菜苔(2个品种)与15种常见蔬菜16种离子组分含量与综合评价，为油菜苔推广提供参考。[方法]利用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定油菜苔和常见蔬菜中16种矿质元素含量，并利用相关分析、聚类分析、离子图谱和对数主成分分析综合评价油菜苔与15种蔬菜的矿质营养品质。[结果]16种矿质元素含量变异大，变异系数由大到小依次为Mo、As、Fe、Pb、Na、Mn、Se、Cd、Ba、Cu、Ca、Mg、K、B、Zn、P;Cu、Fe、Zn之间，有害元素(As、Cd、Pb)及其与Mg、K、Ca、Fe间均达到显著正相关。基于离子组分含量将17种蔬菜划分为5组，组Ⅰ和Ⅱ具有离子协同积累特征，组Ⅲ具有低Na特征，组Ⅳ具有富Se特征，组Ⅴ具有均衡有益元素、低有害元素的特征。依据对数主成分分析将16种元素转化为4个主成分综合指标，累计贡献率达82.035%。矿质营养综合评价值S_f排名前三的蔬菜为菠菜、广东菜心和西芹。四季豆、黄瓜、西兰花以及‘狮山2017’、白菜苔、‘狮山菜苔’中矿质元素含量均衡，胡萝卜和高丽菜中Se含量较高。[结论]油菜苔离子组分含量较均衡，利用对数主成分分析结合相关分析和聚类分析实现了蔬菜品种矿质营养的综合评价。
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  野生种西印度瓜与甜瓜种间杂种的创制

  郑莉娜, 毕研胜, 孙亚亭, 王克征, 钱春桃, 李季, 程春燕, 娄群峰

  南京农业大学学报. 2023, 46(03): 464-472.

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  [目的]本文旨在利用外源优良基因改良栽培甜瓜，拓宽其遗传基础。[方法]选用12份普通甜瓜栽培种和1份野生种材料西印度瓜(Cucumis anguria L.)进行正反种间杂交，通过胚拯救获得以西印度瓜为母本，以栽培甜瓜‘新红瑞’为父本的杂交后代F_1;将F_1与甜瓜进行回交获得BC_1植株，并从形态学、细胞学和分子水平分析评估此次杂交获得的F_1和BC_1。[结果]在胚拯救过程中，4粒F_1幼胚成功萌发了3粒，通过继代和驯化，最终保存了4株杂交后代植株。F_1子代前期生长缓慢、叶片黄化，叶片形状、雄花形状和大小等性状均表现为双亲中间型；F_1生长中后期，以上性状趋同于母本，父本的植物学特征消失。果实的果梗长短和茎部绒毛这2个性状仍表现为居间型。SSR分子标记分析发现，F_1子代中扩增出双亲互补型的条带。形态学和SSR分子标记鉴定都证明了种间杂种F_1的真实性。将杂交后代F_1与甜瓜进行回交，获得了2粒饱满的BC_1种子，BC_1中也检测到了西印度瓜的特征条带，且在田间调查中发现BC_1的卷须有苦味，而西印度瓜和‘新红瑞’的卷须均无苦味。[结论]获得了真实种间杂种F_1,并通过回交将少量外源遗传物质转导到栽培甜瓜中，为利用野生种西印度瓜的优异基因改良栽培甜瓜提供了理论依据和技术参考。
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  菊花CmHB15-1基因克隆及调控木质素合成功能分析

  甘好, 李菲, 蒋甲福, 宋爱萍, 丁莲, 陈发棣, 陈素梅

  南京农业大学学报. 2023, 46(03): 473-481.

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  [目的]本文旨在探究菊花CmHB15-1基因调控木质素合成的功能。[方法]通过同源克隆，以菊花‘神马’cDNA为模板克隆CmHB15-1基因，利用DNAMAN 8.0软件对其进行序列分析，构建pORE-R4-CmHB15-1-GFP载体并导入烟草叶片中进行亚细胞定位分析；利用酵母杂交试验分析其转录激活活性；利用RT-qPCR技术对CmHB15-1基因进行组织特异性表达分析及潜在下游基因分析，并通过遗传转化拟南芥分析其对木质素合成的影响。[结果]CmHB15-1基因的开放阅读框为2 520 bp,编码839个氨基酸，预测蛋白相对分子质量为92.44×10~3,等电点为6.46。CmHB15-1蛋白具有Homeobox、bZIP、START、MEKHLA结构域，与除虫菊TcATHB-15亲缘关系最近。亚细胞定位显示CmHB15-1蛋白定位在细胞核上，有转录激活活性。CmHB15-1基因在茎中的表达量最高，且其表达量从茎顶端向基部节间逐渐增加，在茎基部节间表达量最高。CmHB15-1转基因拟南芥植株OE-20、OE-23木质素含量比野生型分别增加了15.98%和17.99%,且转基因拟南芥植株中木质素合成相关基因苯丙氨酸解氨酶基因(PAL1)、肉桂酸-4-羟基化酶基因(C4H)、4-香豆酰辅酶A连接酶基因(4CL1)、咖啡酰辅酶A甲基转移酶基因(CCoAOMT1)、阿魏酸-5-羟基化酶基因(F5H)表达量均显著上调。[结论]CmHB15-1基因参与调控木质素生物合成。
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  灰霉菌MyosinⅠ的体外表达纯化及抑制剂筛选

  宋国红, 刘松涛, 李林蔚, 刘飞, 张峰

  南京农业大学学报. 2023, 46(03): 482-488.

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  [目的]本文旨在体外表达纯化灰霉菌Ⅰ型肌球蛋白(MyosinⅠ)及筛选抑制剂。[方法]采用SF9昆虫细胞蛋白表达系统表达灰霉菌MyosinⅠ(BcMyosinⅠ)马达结构域，用亲和层析和凝胶过滤层析纯化方法纯化蛋白，用SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达情况。从实验室已有的化合物库中，用ATPase活性试剂盒测定化合物对BcMyosinⅠ的酶活性抑制率。采用菌丝生长速率法测定部分化合物对灰霉菌的菌丝生长抑制活性。以禾谷镰刀菌Ⅰ型肌球蛋白(FgMyosinⅠ)三维结构为模板，同源模建预测BcMyosinⅠ三维结构。用AutoDock-Vina软件将部分化合物与BcMyosinⅠ进行分子对接。[结果]成功在体外表达纯化BcMyosinⅠ。20μmol·L~(-1)条件下，化合物B1和B17对BcMyosinⅠ的酶活性抑制率分别为56.24%和65.39%,显著高于对照药剂氰烯菌酯对酶活性的抑制率(27.29%);B1和B17对灰霉菌的菌丝生长抑制率分别为32.90%和83.44%,显著高于对照药剂氰烯菌酯对菌丝生长的抑制率(1.06%)。对照药剂氰烯菌酯与BcMyosinⅠ的结合自由能为-29.26 kJ·mol~(-1),而化合物B1和B17与BcMyosinⅠ的结合自由能分别为-35.53和-36.78 kJ·mol~(-1),结合自由能低，说明化合物B1和B17对BcMyosinⅠ的抑制活性均高于氰烯菌酯。[结论]成功获得BcMyosinⅠ单体蛋白；筛选出B1和B17两个灰霉菌肌球蛋白抑制剂。
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  植物登陆过程中exocyst复合体的演化

  刘文龙, 胡钢, 周光磊, 李炳君, 吴冬杰, 刘松奇, 鲍依群, 谭小云

  南京农业大学学报. 2023, 46(03): 489-498.

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  [目的]本文旨在研究植物登陆过程中，植物细胞中囊泡拴系因子复合体exocyst的亚基复制、变异和分化的过程和规律，探索其在植物适应陆地环境中的意义。[方法]以7种代表性的藻类和9种代表性的陆生植物的exocyst复合体亚基序列为基础，采用序列比对、进化分析、保守基序鉴定以及高级结构预测的方法，研究植物登陆过程中，exocyst复合物的不同亚基基因复制、变异及结构演化规律，并以拟南芥为陆生植物代表验证其特有的GroupⅢExo70亚基(Exo70G)的亚细胞定位及其基因在干旱和盐胁迫下的表达。[结果]exocyst复合体的内部亚基(Sec3、Sec5、Sec6、Sec8、Sec10和Sec15)在藻类和陆生植物中拷贝数低且序列高度相似，没有显著变化。2个表面亚基(Exo84和Exo70)在登陆过程中，通过复制和变异导致多样化，特别是Exo70亚基中分化产生陆生植物特有的GroupⅢ类群亚基，其定位在反式高尔基体网络上，在干旱胁迫和盐胁迫下高表达。[结论]登陆过程中，植物exocyst内部亚基的数量及结构并没有显著改变，但是exocyst表面亚基的数量及结构发生显著改变，特别是Exo70亚基分化出陆生植物特有的GroupⅢ(Exo70G)亚家族，对植物适应陆地干旱高盐的环境具有积极意义，是植物适应陆地环境的一种进化策略。
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  高产IAA哈茨木霉突变株M95的筛选及其对黄瓜的促生作用

  高雅新, 王甲果, 张翔凯, 李驰, 马磊, 刘东阳, 沈其荣

  南京农业大学学报. 2023, 46(03): 499-509.

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  [目的]本文通过高能射线照射筛选获得哈茨木霉(Trichoderma harzianum)高产生长素(IAA)突变株M95,并研究其对植物的促生效应。[方法]利用X射线照射获得哈茨木霉突变体库，结合Salkowski比色法和高效液相色谱(HPLC)法筛选出IAA产量最高的突变株M95;利用Biolog FF微孔板法研究IAA高产突变株的碳源利用特性；利用荧光定量PCR法测定M95生长素生物合成相关基因的表达水平，并通过水培和盆栽试验探究M95对黄瓜的促生效果。[结果]从突变体库中筛选到38株优势菌株，其中M95的IAA产量较野生株NJAU 4742(WT)提高了20.51%;Biolog FF微孔板试验结果表明，M95在以D-果糖为唯一碳源的条件下生长速度最快并显著高于WT;荧光定量结果表明，M95中吲哚乙酰胺水解酶基因(iaaH2)和腈水解酶基因(nit2)的转录水平比WT分别提高了32.68和14.58倍。M95处理对黄瓜幼苗的促生作用显著优于WT处理，相对于WT处理，M95处理黄瓜株高、叶面积、地下部鲜重和干重，在水培条件下分别增加了14.79%、16.84%、31.41%和47.96%,在第1季盆栽试验中分别增加了20.99%、13.92%、17.92%和34.02%,在第2季盆栽试验中分别增加了12.23%、15.15%、23.29%和30.02%。在盆栽试验中，M95处理根际细菌、真菌和木霉数量较WT处理分别增加1.91%、5.80%和5.08%。[结论]筛选获得了高产IAA菌株哈茨木霉M95,其对黄瓜幼苗生长具有显著的促进作用；M95中吲哚乙酰胺水解酶和腈水解酶转录水平的提高是其产IAA能力提升的主要原因。
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  江苏稻田轮作模式碳、氮足迹分析

  季国军, 纪洪亭, 程琨, 刘满强, 江瑜, 胡正锟, 张岳芳, 胡乃娟, 唐若迪, 胡锋

  南京农业大学学报. 2023, 46(03): 510-521.

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  [目的]稻田通过排放温室气体和活性氮对生态环境带来影响，本文旨在系统分析江苏不同稻田轮作模式碳、氮足迹及其构成。[方法]以江苏新型经营主体为调查对象，利用生命周期评价方法定量分析江苏不同稻田轮作模式碳、氮足迹及其构成。[结果]不同稻田轮作模式单位面积碳足迹和单位面积氮足迹从高到低依次为稻麦轮作(18.22 t·hm~(-2)和139.54 kg·hm~(-2))、稻油轮作(13.20 t·hm~(-2)和101.65 kg·hm~(-2))、稻绿肥轮作(10.20 t·hm~(-2)和73.19 kg·hm~(-2)),单位产量碳足迹和氮足迹在不同轮作模式间差异不显著。不同稻田轮作模式单位面积碳、氮足迹存在区域差异，稻麦单位面积碳、氮足迹和稻油单位面积氮足迹从高到低依次为苏北地区、苏中地区、苏南地区，稻油轮作单位面积碳足迹和稻绿肥轮作单位面积碳、氮足迹在不同地区差异均不显著。对单位产量氮足迹而言，稻麦轮作单位产量氮足迹在不同地区差异显著，而稻麦轮作单位产量碳足迹、稻油和稻绿肥轮作单位产量碳、氮足迹在不同地区差异均不显著。不同轮作模式碳足迹主要来源CH_4排放和氮肥使用导致的碳足迹，占比分别为46.6%～50.7%和23.9%～25.2%。氮肥施用导致的氨挥发、氮素径流、氮素淋失及氮肥投入是不同稻田轮作模式氮足迹的主要来源，占比分别为52.2%～59.0%、14.6%～20.21%、8.7%～10.8%和7.8%～7.9%。[结论]稻油轮作和稻绿肥轮作模式是一种较为低碳和低氮的轮作模式，而考虑粮食安全，选择稻麦轮作模式优于稻油轮作和稻绿肥轮作模式。
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  纳米塑料-脲酶蛋白冠的形成及特征

  张秋歌, 喻燕妮, 戴伟, 栾亚宁

  南京农业大学学报. 2023, 46(03): 522-529.

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  [目的]本研究旨在明确纳米塑料-脲酶蛋白冠的形成及对纳米塑料和脲酶的影响。[方法]以带正电、带负电、不带电的纳米塑料和质量浓度为0.05、0.20、0.50 mg·mL~(-1)的脲酶为试验材料，制备不同的纳米塑料-脲酶混悬液。根据纳米塑料对脲酶的吸附量和形貌特征变化，明确蛋白冠的形成。通过粗糙度、水合粒径、Zeta电位和脲酶构象、活性等指标分析，判定不同条件下蛋白冠的形成对纳米塑料表征及脲酶结构和活性的影响。[结果]不同电性纳米塑料对各浓度脲酶均产生吸附，形成蛋白冠；随着脲酶质量浓度增加，蛋白冠的颗粒粒径和表面粗糙度增加；带正电纳米塑料-脲酶蛋白冠与原纳米塑料差异最显著，且显著抑制脲酶活性；当脲酶质量浓度为0.05 mg·mL~(-1)时，蛋白冠的形成会导致脲酶构象发生明显变化，表现为β-折叠结构含量显著下降，无规则结构含量明显上升的特点。[结论]3种电性纳米塑料均可以和脲酶形成蛋白冠，不同程度降低其分散性和稳定性。蛋白冠对纳米塑料和脲酶的影响强度与纳米塑料的带电性和脲酶质量浓度密切相关。
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  大蒜辣素缓解CCl_4致小鼠急性肝损伤的作用研究

  龚倩梅, 刘永仕, 袁何玲, 吕茜, 王晓明, 黄金虎, 王丽平

  南京农业大学学报. 2023, 46(03): 530-537.

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  [目的]本研究旨在探讨大蒜辣素对四氯化碳(CCl_4)诱导的小鼠急性肝损伤的缓解作用及其潜在作用机制。[方法]将42只小鼠随机分为7组，分别为对照组、大蒜辣素处理组、CCl_4处理组、复方甘草酸苷治疗组(80 mg·kg~(-1))及3个大蒜辣素(40、20和10 mg·kg~(-1))治疗组。小鼠腹腔注射1%CCl_4(10 mL·kg~(-1))8 h后灌胃给予不同剂量的大蒜辣素和复方甘草酸苷，于CCl_4处理48 h后采集小鼠血液和肝脏组织，测定血清生化指标、血清中炎性因子以及肝组织MDA及CAT含量，同时采用Western blot方法检测大蒜辣素对细胞凋亡相关蛋白表达的影响。[结果]单独使用大蒜辣素对小鼠肝脏无损伤作用(P>0.05)。40、20和10 mg·kg~(-1)大蒜辣素均可显著降低CCl_4处理小鼠的血清AST、ALT及ALP活性水平(P<0.05),显著提高肝脏CAT含量和降低MDA含量(P<0.05)。40 mg·kg~(-1)大蒜辣素还可显著降低CCl_4处理小鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平(P<0.05)以及肝组织Bax、Cleaved-Caspase 3和Cleaved-Caspase 9蛋白表达水平(P<0.05),显著提高肝组织NQO_1和Nrf_2蛋白表达水平(P<0.05)。在降低小鼠血清生化指标、炎性因子和MDA水平方面，高、中剂量的大蒜辣素优于复方甘草酸苷(P<0.05)。[结论]大蒜辣素可通过抗氧化、抗炎作用以及减少肝细胞凋亡对CCl_4引起的急性肝损伤起到缓解作用，有望成为新型保肝药物在兽医临床中应用。
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  神经介素B及其受体在不同发育阶段山羊睾丸组织中的差异表达

  曾诚, 夏荣欣, 李悦, 刘婷婷, 孙宣, 钟黄欣, 郭文晴, 张国敏

  南京农业大学学报. 2023, 46(03): 538-544.

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  [目的]本试验旨在探究神经介素B(NMB)及其受体NMBR[还包括胃泌素释放肽受体(GRPR)和蛙皮素受体(BRS3)]在山羊不同发育阶段睾丸组织中的差异表达，为解析哺乳动物睾丸发育及功能调节机制提供参考。[方法]选取系谱清晰和体况良好的雄性山羊12只(3月龄和9月龄，各6只)进行阉割并采集睾丸组织，在克隆NMB及其受体基因与分析序列的基础上，采用免疫组化技术检测NMB及其受体在睾丸组织中的表达定位，利用RT-qPCR和Western blot检测NMB及其受体在不同发育阶段山羊睾丸组织中的表达变化。[结果]NMB及其受体基因与绵羊和牛的进化关系最近，NMB及其受体基因编码区的核苷酸序列与牛和绵羊的同源性达96%以上，结构分析发现NMBR、GRPR和BRS3均属于7次跨膜受体。NMB及其受体在3月龄和9月龄山羊睾丸组织中广泛表达，其中在间质细胞、肌样细胞和精子细胞中呈高表达。与3月龄山羊相比，9月龄山羊睾丸组织中NMB与GRPR的mRNA和蛋白表达量显著降低(P<0.05),而NMBR与BRS3的mRNA和蛋白表达量显著增加(P<0.05)。[结论]NMB及其受体可能参与山羊睾丸发育的调节。
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  利用Cas9/sgRNA体系提高猪胎儿成纤维细胞基因组编辑效率

  姜爱文, 郭鸿运, 吴望军, 刘红林

  南京农业大学学报. 2023, 46(03): 545-554.

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  [目的]本文旨在利用Cas9/sgRNA体系，提高猪胎儿成纤维细胞的基因组编辑效率。[方法]针对猪ROSA26位点的启动子区(包含第一外显子区)设计2条sgRNA,将其构建在PX459-cas9-puro质粒上，以获得PX459-cas9-sgRNA质粒。将sgRNA靶序列连同原间隔序列(protospacer-adjacent motif, PAM)构建在RGS-CR质粒上，以获得RGS-sgRNA质粒。使用PX459-cas9-sgRNA质粒与RGS-sgRNA质粒系统共转染，筛选打靶效率较高的一条sgRNA,并使用该sgRNA对猪胎儿成纤维细胞(PEF)进行后续基因打靶试验。分别使用PX459-cas9-sgRNA质粒和Cas9/sgRNA 2种方法对PEF的靶位点进行基因敲除，将转染后的细胞提取基因组DNA,以桑格尔测序检测打靶效率。[结果]成功构建了打靶猪ROSA26靶序列的PX459-cas9-sgRNA质粒和含PAM序列的RGS-sgRNA,质粒测序结果显示序列插入正确；RGS-sgRNA筛选结果表明，sgRNA2的打靶效率极显著高于sgRNA1(P<0.01),且sgRNA2无脱靶效应，因此后续使用PX459-cas9-sgRNA2和Cas9/sgRNA2在PEF中进行基因打靶试验，并比较两者的基因打靶效率。在猪胎儿成纤维中，PX459-cas9-sgRNA2质粒的打靶效率为15.67%,Cas9/sgRNA2体系的打靶效率为33.33%。[结论]Cas9/sgRNA体系较PX459-cas9-sgRNA质粒打靶效率提高了约1倍，这对提高猪体细胞的基因编辑效率和促进基因编辑在猪上的应用有重要意义。
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  母猪健康和闭锁卵巢有腔卵泡的转录组测序比较分析

  程颖, 魏全伟, 王喆, 雷坤, 吴昊泽, 夏雨婷, 茆达干, 石放雄

  南京农业大学学报. 2023, 46(03): 555-563.

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  [目的]本文旨在通过对猪卵泡颗粒细胞进行转录组测序了解卵泡闭锁相关基因的表达谱并确定闭锁卵泡的潜在分子标记物。[方法]通过HE染色对卵泡及颗粒细胞进行形态学观察；抽取健康卵泡和晚期闭锁卵泡的颗粒细胞，进行转录组测序分析，最后采用实时荧光定量PCR检测差异表达基因的相对表达水平。[结果]转录组数据表明，与闭锁卵泡颗粒细胞相比，健康卵泡颗粒细胞中有771个差异基因，其中204个为上调基因，567个为下调基因；GO功能富集分析显示，差异基因显著富集到320个生物进程中，主要与细胞增殖和血管生成有关；KEGG通路分析表明，差异基因富集到48条信号通路中，主要参与氧化应激、激素合成和能量代谢等方面的信号通路；实时荧光定量PCR结果表明，CYP1B1、PDE10A、NUPR1、NOX4、LDLR、LHCGR和CYP19A1表达趋势与测序结果一致。[结论]氧化应激、血管生成、能量代谢以及激素合成等多方面因素综合调控猪卵巢中颗粒细胞的凋亡，继而影响卵泡闭锁现象的产生。
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  卵泡刺激素对原癌基因c-myc在鸡卵泡上表达的影响

  刘小凡, 谢晓磊, 吴咏梅, 陆应林, 虞德兵

  南京农业大学学报. 2023, 46(03): 564-571.

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  [目的]本试验旨在研究c-myc基因在鸡卵泡上的表达及卵泡刺激素(FSH)对其的诱导作用，为明确c-myc在鸡卵泡发育过程中的相关机制提供理论基础。[方法]体外分离鸡小白卵泡(SWF)、大白卵泡(LWF)、小黄卵泡(SYF)、F4和F1卵泡颗粒层和膜层，检测c-myc mRNA和蛋白的表达；应用50 ng·mL~(-1)FSH处理小黄卵泡36 h,测量卵泡颗粒层的厚度和密度，检测颗粒层和膜层c-myc、标记基因和周期相关基因的表达；体外分离、培养小黄卵泡颗粒细胞，预培养16 h,用siRNA干扰c-myc 24 h后，加入50 ng·mL~(-1) FSH处理24 h,检测c-myc mRNA的表达。[结果]c-myc mRNA在等级前卵泡的颗粒层和膜层的表达水平都显著高于排卵前卵泡，卵泡的颗粒层和膜层上都有c-Myc蛋白表达。与对照组相比，FSH处理后，小黄卵泡颗粒层厚度增加约25.5%(P<0.05),密度增加约27.8%(P<0.01)。在小黄卵泡颗粒层上，FSH降低了c-myc和类固醇激素合成急性调节蛋白(star)mRNA的表达水平(P<0.05),提高了细胞增殖抗原(pcna)和周期蛋白D2(ccnd2)mRNA的表达水平(P<0.01);在卵泡膜层上，FSH提高了c-myc和pcna mRNA的表达水平(P<0.05),极显著提高了ccnd2和star mRNA的表达水平(P<0.01)。FSH能提高c-myc敲减后颗粒细胞c-myc mRNA的表达水平(P<0.05)。[结论]FSH能诱导c-myc在鸡颗粒细胞中的表达，推测c-myc与体外培养的鸡小黄卵泡颗粒细胞的终端分化有关。
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  小体型肉鸭剩余采食量与屠宰性能及肉品质的相关性分析

  杨宝龙, 董钊绮, 李潇凡, 吴双, 宋倩倩, 卞友庆, 江勇, 常国斌, 陈国宏, 白皓

  南京农业大学学报. 2023, 46(03): 572-578.

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  [目的]本文旨在研究小体型肉鸭剩余采食量(RFI)与屠宰性能和胸肌肉品质的关系。[方法]选取1 000只21日龄小体型肉鸭单笼饲养至63日龄，测定22～63日龄的RFI。于63日龄随机挑选72只肉鸭(公母各半)屠宰，测定其屠宰性能和胸肌肉品质，再对RFI与屠宰性能和肉品质进行相关性分析。[结果]在生长性能方面，公鸭的22日龄体重(BW22)、63日龄体重(BW63)、平均日采食量(ADFI)和平均日增重(ADG)均极显著高于母鸭(P<0.01),料重比(F/G)和RFI极显著低于母鸭(P<0.01)。RFI与F/G、ADFI呈极显著正相关(P<0.01)。在屠宰性能方面，公鸭的屠宰率、半净膛率、全净膛率、胸肌率、腿肌率、瘦肉率、腹脂率和肌胃率与母鸭相比均差异不显著(P>0.05)。RFI与胸肌率及瘦肉率呈显著负相关(P<0.05)。在肉品质及营养成分方面，公鸭的胸肌黄度值(b~*)显著高于母鸭(P<0.05),pH_(24 h)值显著低于母鸭(P<0.05),胶原含量显著低于母鸭(P<0.05),但公鸭的失水率极显著高于母鸭(P<0.01)。RFI与胸肌亮度(L~*)呈显著负相关(P<0.05),与剪切力呈显著正相关(P<0.05),与胸肌胶原含量呈显著正相关(P<0.05)。[结论]对RFI的选育可以有效提高小体型肉鸭的饲料利用率且能改善部分屠宰性能指标和肉品质指标，为小体型优质肉鸭饲料效率的改良和选育提供参考。
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  日本沼虾对6种蛋白质原料中蛋白质、氨基酸及磷的离体消化率研究

  孙淼, 张玲, 葛亚平, 陈伟亮, 刘波, 刘文斌, 李向飞

  南京农业大学学报. 2023, 46(03): 579-586.

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  [目的]本文旨在探究日本沼虾对6种蛋白质原料中蛋白质、氨基酸及磷的离体消化率及酶解能力，为日本沼虾饲料的开发提供指导。[方法]分别以鱼粉、血粉、豆粕、棉粕、菜粕与花生粕为蛋白质原料，采用离体消化法和茚三酮法测定日本沼虾肝胰腺与胃肠道粗酶提取液对这6种原料中干物质、粗蛋白和总磷的离体消化率，以及酶解后氨基酸的生成量和酶解液中磷含量。[结果]肝胰腺粗酶提取液处理下，豆粕组中干物质的消化率最高，且显著高于血粉组(P<0.05);粗蛋白离体消化率以棉粕为最高，显著高于除豆粕外的其他原料(P<0.05);总磷消化率以花生粕最高，显著高于鱼粉组(P<0.05)。胃肠道粗酶提取液处理下，菜粕的干物质消化率最高，且显著高于棉粕和血粉组(P<0.05),而粗蛋白和总磷的消化率均以棉粕为最高。此外，在肝胰腺和胃肠道粗酶提取液处理下，6种蛋白原料生成的氨基酸含量均随消化时间的延长显著升高，而鱼粉和血粉的氨基酸生成量显著高于其他蛋白原料(P<0.05)。胃肠道粗酶液中的磷含量随时间延长呈先升高后降低的趋势，在8 h处，鱼粉组磷含量显著高于其他组(P<0.05)。[结论]日本沼虾对棉粕的离体消化率较高，而血粉在酶解过程中的氨基酸生成量较高，二者均可作为日本沼虾优质蛋白来源，在饲料生产中具有较大的应用前景。
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  基于脉冲光的冰鲜鸡保鲜技术研究

  丁紫璇, 王静文, 胡海静, 韩敏义, 邓绍林, 徐幸莲, 王虎虎

  南京农业大学学报. 2023, 46(03): 587-594.

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  [目的]本文旨在研究脉冲光技术对冰鲜鸡的减菌效果，为其在冰鲜鸡产业中的应用提供基础。[方法]以脉冲电压、脉冲距离和脉冲时间为试验因素，设置单因素和Box-Behnken试验确定最优杀菌条件，并通过细菌数量和理化指标评估脉冲光技术对冰鲜鸡贮藏货架期的影响。[结果]脉冲光对冰鲜鸡的杀菌效果在一定条件下随脉冲电压增加、时间延长及距离缩短而显著增强(P<0.05)。响应面优化出的脉冲光杀菌条件为：电压8 V,距离3 cm,时间12 s。在此条件下冰鲜鸡初始菌落总数、大肠菌群数和假单胞菌数分别降低了0.91、0.86和1.05 lg(CFU·g~(-1)),验证结果表明优化参数可信度高。脉冲光能显著抑制冰鲜鸡表面菌落总数、大肠菌群数的增长，有效减缓pH值、挥发性盐基氮(TVB-N)含量和生物胺含量的升高，脉冲光技术可将冰鲜鸡货架期从3 d延长到6 d。[结论]脉冲光技术对冰鲜鸡的微生物控制效果较好，在产业中具有较高的推广价值。
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  基于电子鼻和高光谱成像技术的冷鲜牛肉微生物的生长模型构建

  刘小花, 周彬静, 彭菁, 屠康, 吴菊清, 徐静, 武杰, 潘磊庆

  南京农业大学学报. 2023, 46(03): 595-605.

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  [目的]本文旨在探究基于电子鼻和高光谱成像技术实现冷鲜牛肉中微生物生长曲线拟合的可行性。[方法]采用平板计数法测定4℃恒温贮藏下冷鲜牛肉中的菌落总数，并采集其电子鼻和高光谱数据；采用Huang模型和Baranyi模型建立基于传统平板计数法、电子鼻和高光谱特征信息的生长模型，并对其进行比较。[结果]基于传统平板计数法构建的生长模型精度较高，模型决定系数R~2高达0.993;与平板计数法相比，基于电子鼻特征信息的方法ⅰ和ⅱ所建的生长模型精度略低，R~2大于0.871,二者之间的相关系数r为0.917～0.994。基于高光谱信息的方法Ⅰ所建模型R~2与之相当，r高达0.998;而基于高光谱响应值的方法Ⅱ所建的模型表现稍差，R~2为0.749～0.918,r为0.761～0.859。[结论]电子鼻和高光谱特征信息可用于冷鲜牛肉微生物生长曲线拟合，这为无损检测技术在预测微生物学领域的应用提供了理论支持和技术参考。
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  基于改进YOLO v5复杂场景下肉鹅姿态的检测算法研究

  刘璎瑛, 曹晅, 郭彬彬, 陈慧杰, 戴子淳, 龚长万

  南京农业大学学报. 2023, 46(03): 606-614.

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  [目的]肉鹅姿态是预警肉鹅异常行为、评判肉鹅健康状态的重要指标，针对传统养殖场人工观察肉鹅姿态耗时费力且有很大主观性等问题，提出了一种基于深度学习模型自动识别肉鹅姿态的检测算法。[方法]利用YOLO v5模型对扬州鹅4种姿态(站立、休憩、饮水和梳羽)进行识别；对YOLO v5模型加入SENet、CBAM、ECA三种注意力模块改进网络结构，提高模型的识别能力；设计明暗试验和密集场景试验进一步验证模型在复杂场景下的鲁棒性。[结果]YOLO v5+ECA模型的平均检测精度(mAP)为88.93%,相比YOLO v5提升了2.27%。在识别精度(AP)上，站立姿态为91.85%,休憩姿态为93.42%,饮水姿态为90.02%,梳羽姿态为80.42%。在明暗试验和密集场景试验中，YOLO v5+ECA模型性能表现稳定，漏检现象和误检现象相对较少。[结论]该模型可以实现养殖场复杂场景下肉鹅姿态准确快速检测，为后续肉鹅行为监控和健康防疫提供数据支撑。
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  基于GWQPSO-SVM的水产养殖水总磷软测量系统设计与试验

  周俊博, 蒋冬, 肖茂华, 朱虹, 汪小旵, 陈爽

  南京农业大学学报. 2023, 46(03): 615-625.

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  [目的]总磷是影响水产养殖水质质量的重要参数之一，而目前市场上总磷测量装置价格昂贵，实时监测成本高。为实现低成本水产养殖水质监测，设计了基于灰狼量子粒子群-支持向量机(grey wolf quantum particle swarm optimization-support vector machine, GWQPSO-SVM)的水产养殖水质监测系统。[方法]首先，选用传感器组、STM32F103单片机、ESP8266WIFI无线通信模块搭建水质监测系统数据处理模块；分析与水质总磷含量相关性强的水质参数，据此确定系统传感器的选型，设计水质监测系统服务器交互端，开发水质监测小程序对水质等级进行实时监测。其次，提出GWQPSO算法，对SVM进行优化，据此提出GWQPSO-SVM总磷软测量模型。最后，采用南京通威水产科技有限公司的养殖水塘的80组历史水质数据作为训练数据，实时采集55组水质数据作为测试数据对GWQPSO-SVM总磷软预测模型进行试验验证。[结果]试验结果表明，GWQPSO-SVM的5种误差分别为2.297 0、0.041 8、0.274 7、0.003 6、0.059 9,相较于SVM模型，分别下降了65.70%、65.68%、61.85%、88.16%、65.63%;GWQPSO收敛时的迭代次数、最终收敛适应度分别为74、0.081 2,相较于PSO算法，分别下降了87.84%、10.47%。[结论]本文研究可为水产养殖业提供一种高精度、低成本的水质参数测量技术方案。
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  基于BAS-BP模型HMCVT换段液压系统故障的诊断方法

  王家博, 张海军, 赵余祥, 刘永华, 肖茂华, 鲁植雄, 王光明

  南京农业大学学报. 2023, 46(03): 626-634.

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  [目的]为了提高液压机械无级变速器(HMCVT)换段液压系统的平稳性和安全性，设计了一种应对换段液压故障的诊断方法。[方法]利用自主研发的液压机械无级变速器试验平台，获得5种油路故障状态模式数据集；通过数据预处理及随机抽取的方法得到120组单一故障样本集和21组组合故障样本集，基于天牛须搜索算法(beetle antennae search, BAS)和BP(back propagation)神经网络，对处理后的120组单一故障样本建立了故障诊断模型；对标准BP神经网络模型和优化型BP神经网络模型进行试验测试和比对研究。[结果]所使用的BAS-BP方法对试验样本实现了5种油路状态模式分类；与标准BP神经网络相比，BAS-BP方法可以更好防止网络受限于局部极小值，且故障诊断正确率提升10%。[结论]与常规优化算法相比较，BAS-BP方法所需训练时间短、收敛速度快，算法运行速率提升85.76%,拥有更好的稳定性和判别精度。特别需要指出的是，该方法对于组合故障的判别仍然有效。