[目的]本文旨在体外表达纯化灰霉菌Ⅰ型肌球蛋白(MyosinⅠ)及筛选抑制剂。[方法]采用SF9昆虫细胞蛋白表达系统表达灰霉菌MyosinⅠ(BcMyosinⅠ)马达结构域，用亲和层析和凝胶过滤层析纯化方法纯化蛋白，用SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达情况。从实验室已有的化合物库中，用ATPase活性试剂盒测定化合物对BcMyosinⅠ的酶活性抑制率。采用菌丝生长速率法测定部分化合物对灰霉菌的菌丝生长抑制活性。以禾谷镰刀菌Ⅰ型肌球蛋白(FgMyosinⅠ)三维结构为模板，同源模建预测BcMyosinⅠ三维结构。用AutoDock-Vina软件将部分化合物与BcMyosinⅠ进行分子对接。[结果]成功在体外表达纯化BcMyosinⅠ。20μmol·L~(-1)条件下，化合物B1和B17对BcMyosinⅠ的酶活性抑制率分别为56.24%和65.39%,显著高于对照药剂氰烯菌酯对酶活性的抑制率(27.29%);B1和B17对灰霉菌的菌丝生长抑制率分别为32.90%和83.44%,显著高于对照药剂氰烯菌酯对菌丝生长的抑制率(1.06%)。对照药剂氰烯菌酯与BcMyosinⅠ的结合自由能为-29.26 kJ·mol~(-1),而化合物B1和B17与BcMyosinⅠ的结合自由能分别为-35.53和-36.78 kJ·mol~(-1),结合自由能低，说明化合物B1和B17对BcMyosinⅠ的抑制活性均高于氰烯菌酯。[结论]成功获得BcMyosinⅠ单体蛋白；筛选出B1和B17两个灰霉菌肌球蛋白抑制剂。