旨在探究中原地区牛肠道病毒（BEV）的生物学特性及其5′-UTR序列遗传特征。采用RT-PCR方法对2023—2024年从四川、河南和河北地区收集的77份腹泻牛粪便样品进行BEV检测，对阳性样本的BEV 5′-UTR序列进行克隆及遗传变异分析，通过接种Madin-Darby牛肾细胞（MDBK）进行病毒分离与鉴定。结果：77份牛粪便样品中有20份（25.97%）检测为BEV阳性，获得20株BEV 5′-UTR核苷酸序列；20株BEV与13株BEV参考毒株5′-UTR序列同源性为77.2%～94.1%;遗传变异分析显示，获得的20株BEV序列中17株属于BEV-F种，余下3株属于BEV-E种；分离到2株BEV,命名为HB002、HN004-8,均为BEV-F种，病毒滴度均在48 h时达到高峰，分别为10^5.49 TCID₅₀/μL和10^5.67 TCID₅₀/μL;电子显微镜观察病毒粒子呈球形，直径20～30 nm。本研究为BEV感染的防控提供了参考。