为研发一种更安全、有效的防控牛布氏杆菌病和分枝杆菌病的疫苗，运用在线软件ABCPerd和IEBD对牛布氏杆菌外膜蛋白(Omp25)和牛分枝杆菌抗原85A(Ag85A)的B、T细胞表位进行预测分析，设计新的表位基因肽段NewⅠ和NewⅡ,并通过SOPMA和VaxiJen在线软件对NewⅠ和NewⅡ的二级结构与抗原性进行分析。将NewⅠ、Omp25、NewⅡ和Ag85A基因序列依次用自剪切肽T2A、P2A、E2A进行连接，获得串联基因并命名为COE,将COE基因构建至真核表达载体GV658,获得重组质粒GV658-COE;将上述重组质粒转染至HEK293细胞，利用细胞计数(CCK-8)试验评估GV658-COE对细胞的安全性，通过免疫印迹分析目的蛋白的表达情况；将重组质粒以400μg/只的剂量免疫大鼠，检测在第3次免疫后的血清抗体及大鼠脾淋巴细胞中的T细胞亚群占比情况。结果显示：NewⅠ和NewⅡ序列二级结构较稳定，抗原性良好；重组质粒经PCR扩增获得3 231 bp大小的目的条带，与预计相符；重组质粒对HEK293细胞无毒性作用；重组质粒在HEK393细胞中可表达出目的蛋白，分别在22.3、17.3、23.9和35.6 kDa处有目的蛋白NewⅠ、Omp25、NewⅡ和Ag85A的表达。三免后，重组质粒免疫大鼠产生的IgG水平均高于空载质粒组和PBS组；与PBS组相比，重组质粒免疫大鼠脾脏中CD4~+和CD8~+ T淋巴细胞百分比均升高。研究表明，重组质粒GV658-COE能有效激发大鼠的体液免疫和细胞免疫反应，可成为预防牛布氏杆菌病和分枝杆菌病的候选疫苗。