为了解近年来H9N2亚型禽流感病毒的分子特征和抗原变异情况，本研究对选自2019—2020年的9株H9N2亚型禽流感病毒的血凝素(HA)基因序列进行分析，进一步利用交叉血凝抑制试验和中和试验对抗原性进行分析，并以此筛选出候选疫苗株，开展免疫原性和攻毒保护试验研究。9株病毒HA基因核苷酸同源性为91.2%～98.9%,表明这些毒株之间HA基因分化明显。9株病毒HA蛋白裂解位点序列均为RSSR,符合低致病性禽流感病毒分子特征。所有9株病毒HA均含有7个潜在的糖基化位点。9株病毒HA关键受体结合位点的234位氨基酸由谷氨酰胺变为亮氨酸，提示这些毒株具有结合α2,6-Sialidase受体的能力。交叉血凝抑制试验显示各毒株之间出现最大64倍的抗原性差异，交叉中和试验显示各毒株之间出现最大1 024倍的抗原性差异。根据中和试验结果，利用AntigenMap制作抗原图谱，可以看出9株病毒可以分为2个主要抗原群。筛选的Y2432毒株制备灭活疫苗免疫鸡群后21 d,针对同源毒株平均血凝抑制(HI)抗体效价达到13.6 log_2,使用同源毒株和异源毒株进行攻毒，保护率均为100%。Y2432免疫SPF鸡，14 d即可产生高水平抗体，最高可达到14.4 log_2,且抗体可维持140 d以上。筛选的候选疫苗株免疫原性和免疫保护效果较好，为预防H9N2亚型禽流感的流行提供了重要技术储备。