为了建立一种准确快速的牛支原体(Mycoplasma bovis)抗体检测方法，对牛支原体P48蛋白进行原核可溶性表达，采用SDS-PAGE、Western blot对蛋白进行鉴定，将鉴定正确的P48重组蛋白作为抗原，对影响ELISA的各个因素进行方阵优化，建立间接ELISA检测方法，对其特异性、敏感性、重复性进行测试，并进行临床样品检测。结果显示：抗原包被浓度为5μg/mL,4℃包被过夜；10%马血清为最佳封闭液，封闭时间为2 h;一抗最佳稀释度为1∶160,孵育时间为1 h;酶标二抗最佳稀释度为1∶12 000,孵育时间为30 min;最佳显色时间为20 min。表达纯化的P48蛋白可以与牛支原体血清、乳样发生特异反应，建立的间接ELISA方法具有良好的敏感性、特异性和重复性，与商品化牛支原体ELISA抗体检测试剂盒总体符合率为91.11%。结果表明，本研究建立了一种特异性、敏感性、重复性良好的牛支原体抗体间接ELISA检测方法，为牛支原体病防控及抗体水平检测提供了一种有效方法。