本研究设计、合成了分别靶向伪狂犬病病毒(PRV)gE基因和猪圆环病毒4型(PCV4)Cap基因保守区域的特异性引物，并在优化反应条件的基础上，建立了能够同时检测和鉴别PRV和PCV4的二重SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。结果显示，该方法具有良好的线性关系，R~2=0.999。在同一个反应体系中，能够特异地检测到PRV和PCV4的特定荧光信号，而其他病原体无信号；对PRV和PCV4的检测限分别为48.5 copies/μL和40.8 copies/μL。利用建立的二重荧光定量PCR方法对34份猪临床样品进行检测，结果显示，PRV检出率为44.12%(15/34),PCV4检出率52.94%(18/34),且二者混合感染的检出率为32.35%(11/34),比常规PCR方法更加灵敏。该方法是检测PRV和PCV4的一种快速、灵敏、特异的方法。