为制备猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus, PHEV)N蛋白的单克隆抗体，本研究构建了pET-32a-N重组质粒，原核表达并纯化重组N蛋白，免疫BALB/c小鼠，细胞融合后利用间接ELISA进行筛选，获得了3株稳定分泌的阳性杂交瘤细胞株，分别命名为2C3、4F3、5C6。Western blot与间接免疫荧光试验表明，3株单抗均能与293T细胞中表达的N蛋白产生特异性反应。经测定，3株单抗的效价均为1×10~6,重链类型均为IgG1,轻链类型均为κ。利用一系列表达的部分重叠的N截短蛋白片段，经Western blot鉴定单抗所识别的抗原表位，结果显示，~(267)KPRQK~(271)为单抗2C3、4F3、5C6所识别的表位。本研究为PHEV临床检测方法的建立和表位疫苗的研发奠定了基础。