目的 通过RNA干扰技术敲低非小细胞肺癌H1299细胞的Notch3基因表达，初步探讨敲低Notch3对H1299细胞糖代谢的影响。方法 利用表达Notch3 shRNA的慢病毒包装质粒和嘌呤霉素(puromycin)抗生素筛选、构建Notch3敲低的H1299细胞系，通过Western blot确认敲减细胞系的建立；CCK-8检测细胞增殖，验证敲减对细胞功能的影响；糖酵解压力测试试剂和Seahorse能量仪检测细胞外酸化率；Western blot检测糖酵解关键酶己糖激酶(HK2)、丙酮酸激酶M2(PKM2)蛋白表达；JC-1染色和流式细胞仪检测线粒体膜电位。结果 基因敲减后，Notch3蛋白表达水平降低，抑制细胞增殖，表明成功建立Notch3敲减细胞系。Notch3敲减降低线粒体膜电位，提高HK2和PKM2的表达水平和细胞外酸化率。结论 Notch3稳定敲低细胞系构建成功，Notch3敲低抑制H1299细胞的增殖，促进细胞的糖酵解。