目的 基于四维数据独立采集（4D-data-independent acquisition,4D-DIA）蛋白质组学技术，探究高糖致体外血脑屏障（blood brain barrier,BBB）损伤的机制。方法 用小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3构建体外BBB模型，随机分为高糖组和对照组，高糖组接受含200 mmol/L葡萄糖的培养基处理24 h，对照组接受相同渗透压的含25 mmol/L葡萄糖的培养基处理24 h。检测跨内皮电阻（transepithelial resistance, TEER）及辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）评估体外BBB的通透性。利用4D-DIA技术检测并比较两组间差异蛋白的表达，对差异蛋白进行京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集分析。结果 与对照组相比，高糖组HRP升高，TEER降低（均P<0.05）。两组共鉴定出603个差异蛋白，其中显著上调蛋白444个，显著下调蛋白159个。KEGG通路分类分析结果显示，差异蛋白主要富集于转运与分解代谢、信号转导、能量代谢、免疫系统等。KEGG信号通路分析显示，差异蛋白主要与氧化磷酸化、代谢等信号通路有关。结论 高糖可能通过氧化磷酸化、代谢等信号通路影响内皮细胞的转运与分解代谢、信号转导、能量代谢、免疫系统等，进而增加体外BBB的通透性。