目的：旨在建立树鼩耳缘成纤维细胞体外分离、培养纯化及鉴定的方法。方法：采用组织块贴壁法进行原代树鼩耳缘成纤维细胞（TSEF）的分离培养，将获得的细胞利用波形蛋白（Vimentin）进行免疫荧光鉴定，RT-qPCR法检测Vimentin基因mRNA的相对表达量；用苏木精—伊红（HE）染色，观察细胞形态；用细胞增殖试剂盒（CCK-8）检测TSEF的增殖情况；利用流式细胞仪检测第3代和第5代细胞周期和凋亡的情况。结果：通过组织块贴壁法可以成功分离出树鼩的耳缘成纤维细胞，在倒置荧光显微镜下原代细胞呈现出长梭形、多触角、鱼群状等形态；细胞免疫荧光Vimentin呈现强阳性；TSEF Vimentin mRNA的相对表达量与小鼠3T3 Swiss albino细胞Vimentin mRNA的相对表达量无明显差异（P>0.05）。HE染色结果显示，该细胞形态呈典型的长梭形或星形，细胞质染为淡紫色，细胞核着深紫色，为规则的卵圆形；检测原代细胞增殖情况，细胞增殖曲线呈典型的S形，且第2至第3天是细胞的最佳增殖期。第3代和第5代细胞在G0/G1期所占的比例没有明显地改变（P>0.05），且处于G0/G1期的细胞占主导地位；两代细胞的凋亡率较低且没有明显变化（P>0.05）。结论：组织块贴壁法可成功提取TSEF，且细胞在第3至第5代内生长状况良好，可用于体细胞核移植等科学研究活动