目的：探讨circACTN4对乳腺癌（BC）细胞恶性生物学行为的影响，并分析其作用机制。方法：收集2019年1月至2021年12月在唐山市妇幼保健院就诊的45例BC患者的肿瘤组织和邻近的非肿瘤组织；体外培养BC细胞系MDA-MB-468、MDAMB-231、SK-BR-3、MCF-7和人乳腺上皮细胞MCF-10A。RT-qPCR和Western blotting检测circACTN4、miR-424-5p和亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）在BC组织和细胞系中的表达。另取MCF-7细胞分为Control组（常规培养）、si-NC组（转染siNC）、si-circACTN4组（转染si-circACTN4）、si-circACTN4+in-miR-424-5p组（转染si-circACTN4和in-miR-424-5p）和si-circACTN4+oe-MTHFR组（转染si-circACTN4+oe-MTHFR），采用CCK-8和克隆形成测定分析细胞增殖能力；Transwell检测BC细胞的迁移和侵袭。双荧光素酶报告基因分析miR-424-5p与circACTN4或MTHFR之间的靶向关系。构建裸鼠异种移植瘤模型，探究circACTN4对体内肿瘤生长的影响。结果：与非肿瘤组织和人乳腺上皮细胞MCF-10A相比，BC组织和细胞系中circACTN4和MTHFR表达上调，miR-424-5p表达下调（P<0.05）。与si-NC组相比，si-circACTN4组BC细胞增殖活力、克隆形成数以及迁移、侵袭细胞数均下调（P<0.05）。与si-circACTN4组相比，si-circACTN4+in-miR-424-5p组和si-circACTN4+oeMTHFR组BC细胞增殖活力、克隆形成数以及迁移、侵袭细胞数均上调（P<0.05）。circACTN4通过靶向BC细胞中的miR-424-5p上调MTHFR表达。circACTN4敲低可抑制裸鼠体内肿瘤生长。结论：敲低circACTN4调控miR-424-5p/MTHFR轴抑制BC细胞增殖、迁移和侵袭。