目的：通过了解广西某高校细胞培养实验室的运行管理情况，以及检测细菌、支原体污染状况，为促进实验室的规范管理提供参考依据。方法：在广西某高校随机抽取8个细胞培养实验室并进行采样，琼脂细菌培养法检测细菌总数，PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测支原体污染情况。结果：本研究所调查的实验室各采样点均存在不同程度的细菌污染和支原体污染，其中房间角落、地面中央、安全柜落脚处、培养箱外侧扶手以及内壁均可检出细菌（样本阳性率100.00%），显微镜旁台面和培养箱水样的细菌阳性检出率分别为75.00%、12.50%。支原体阳性检出率较高的采样点依次为细胞培养箱水样（100.00%）、房间角落（75.00%）、培养箱外侧扶手（62.50%）和安全柜下方落脚处（62.50%）。人员流动频繁的实验室房间角落、房间地面中央，以及安全柜落脚处的细菌数目均多于人员相对稳定的实验室（P<0.05）。3个时间点（紫外照射30 min、无人员操作运行30 min与人员操作30 min后）生物安全柜内表面的样本未培养出细菌，但部分能检出支原体阳性。结论：人员流动频繁的实验室发生污染的可能性更高，生物安全柜隔绝支原体污染的效果欠佳。加强人员管理、建立清洁制度以及加强生物安全柜维护方可有效避免微生物污染。