为快速检测与鉴别鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)和鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS),本研究根据NCBI数据库中2种病原的16S rRNA基因序列的保守区，分别设计引物和TaqMan探针，通过优化反应条件，建立了一种可同时检测MG和MS的双重TaqMan荧光定量PCR方法，并对其特异性、敏感性、重复性和可靠性进行了验证。结果显示，该方法可特异性扩增MG和MS,与21种病原无交叉反应；对MG与MS阳性标准品的检测限分别为5.40×10～1、6.60×10～1拷贝/μL,敏感性较已知方法提高10～100倍；组内和组间的变异系数均小于1%;与NY/T 553-2015中的单一PCR扩增方法相比，阳性样品、阴性样品及总样品检测符合率均为100.00%;利用该方法检测84份疑似支原体感染的鸡病料样品，结果显示，单一感染MG的病鸡样品阳性率32.14%(27/84)、单一感染MS的样品阳性率22.62%(19/84)、混合感染MG和MS的样品阳性率16.67%(14/84);此外，检测182份健康鸡泄殖腔拭子样品、118份健康鸡鼻拭子样品及74份养鸡场环境样品，结果显示，各类样品中均可检测出支原体阳性样本。结果表明，该方法可适用于多种类型临床样品的检测。综上所述，本研究建立的双重TaqMan荧光定量PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点，可用于MG和MS感染的临床鉴别检测、流行病学调查及病原的净化。