由于A型塞内卡病毒(SVA)、水泡性口炎病毒(VSV)新泽西血清型(VSNJV)和印第安纳血清型(VSIV)均可感染猪群，引起口唇及蹄部水疱性损伤，且临床症状相似，易造成误诊。因此，本研究根据SVA-P基因、VSNJV-N基因、VSIV-N基因的保守区分别设计了3对特异性引物，优化了退火温度、引物浓度及反应体系；并利用纳米金材料，建立了一种能同时检测SVA、VSNJV和VSIV的新型、快速、灵敏的多重纳米PCR检测方法。特异性试验结果表明，该检测方法可特异性扩增SVA、VSNJV和VSIV目的基因，且与猪伪狂犬病毒(PRV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)和猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)均无交叉反应性。敏感性试验结果显示，该检测方法的最低核酸检测限为10拷贝/μL,敏感性较好。此外，最优引物比对不同批次的酶和质粒反应性良好，稳定性强。应用该方法对50份病猪样品进行检测，检出SVA阳性样品7份，普通单一PCR方法检出SVA阳性样品5份；2种检测方法均未检出VSNJV和VSIV阳性。结果表明，本研究建立的多重纳米PCR方法在检测SVA、VSNJV和VSIV方面具有更高的特异性和敏感性，可为猪病毒性水疱性疾病的快速鉴别诊断及防控提供技术支持。