猪肠道冠状病毒(SeCoV)包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV),是引起仔猪严重腹泻的主要病原体，给养猪业造成了巨大的损失。为快速、准确地检测和鉴别这3种病毒，本研究建立了一种三重实时荧光定量反转录PCR(RT-qPCR)方法，用于同时检测PEDV、TGEV和PDCoV。根据PEDV M基因、TGEV ORF 1b基因和PDCoV ORF 1b基因的保守序列分别设计了特异性引物和探针。优化反应条件后，成功建立了一种能同时检测PEDV、TGEV和PDCoV的三重RT-qPCR方法。该方法对这3种病毒具有良好的特异性，与猪场常见的猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪A群轮状病毒(PoRVA)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等均无交叉反应。对重组质粒pTOPO-PEDV 128、pTOPO-TGEV 116和pTOPO-PDCoV 125线性模板的检测极限分别为16.835、17.610、17.020拷贝/μL。组内、组间变异系数均小于5%,且组间差异不显著(P>0.05)。与标准方法的符合性比较结果显示，三重RT-qPCR的检测符合率为100%,在35份组织样本的检测中，17份呈PEDV阳性，阳性率为48.57%(17/35),TGEV和PDCoV的检测结果均为阴性，未检测到混合感染。结果表明，建立的三重RT-qPCR方法特异、灵敏、稳定、快捷，可同时用于PEDV、TGEV和PDCoV的临床检测和鉴别诊断，为猪腹泻冠状病毒的检测和流行病学调查提供了一种高效、可靠的技术手段。