产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是引发仔猪腹泻的主要原因，严重影响畜牧业发展。为有效防治仔猪腹泻，将筛选的K88(FTDYEGASVELRKPDGGTNK)、K99(NVGNGSGGANIN)、987P(LAAPAENNTSQAN)、F41(VMAADWTEGQPGDII)和F18(PPNAQTYPLSSGDLK)ETEC黏附素的中和表位组装，以构建FaeG-FanC-FasA-FedF-Fim41a多表位融合抗原(multi-epitope fusion antigens, MEFA),经计算机模拟和体外试验验证其免疫原性。计算机模拟结果显示，该MEFA具有优异的理化性质且二级结构和三级结构预测结果合理，与Toll样受体3进行分子对接时表现出较强的相互作用力，动力学模拟显示可稳定呈递。体外验证结果显示抗K88、K99、987P、F18和F41卵黄抗体(IgY)能特异性识别MEFA蛋白。将MEFA蛋白免疫产蛋鸡后，获得的MEFA IgY对5种ETEC的滴度均高于非特异性IgY。此外，MEFA IgY能显著抑制K88、K99、987P、F41和F18 ETEC菌株对仔猪小肠IPEC-J2细胞系的黏附。这些结果表明，MEFA具有强免疫原性，可以作为预防K88、K99、987P、F41和F18 ETEC感染的理想候选疫苗，为开发ETEC多价化广谱性候选疫苗提供参考依据和技术支撑。