为实现鸭甲型肝炎病毒3型（DHAV-3）的快速检测，本试验首先对DHAV-3的非结构蛋白3D进行原核表达，纯化后免疫BALB/c小鼠，四免后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）融合制备单克隆抗体，进而利用单克隆抗体建立双抗夹心ELISA（DAS-ELISA）检测方法，评估其灵敏性、特异性和重复性，最后将所建方法应用于临床样本的检测，并与RT-PCR方法进行符合性验证。结果显示：DHAV-3 3D蛋白在BL21（DE3）中高效表达，经Western blot验证，纯化后的蛋白其特异性良好；细胞融合后经3次亚克隆，成功筛选到6株杂交瘤细胞，分别命名为1A3、1B6、1C7、1D9、2A1和3A9,抗体亚型鉴定结果显示1A3为IgG2b, 1B6为IgG2a, 3A9为IgG3,1C7、1D9和2A1均为IgG1;经筛选，将1B6和1A3两株亲和性高的单抗分别作为捕获抗体与检测抗体，建立DAS-ELISA检测方法，优化反应条件后确定捕获抗体1B6最佳包被质量浓度为1×10^-3 g/L,检测抗体1A3的最佳稀释度为1∶1 000,阴阳临界值（cut-off）为0.256;灵敏性试验显示该方法对3D蛋白的最低检测限度为4.0×10^-4 g/L;重复性试验显示，该方法批内、批间变异系数（Cv）均小于9%,重复性好；特异性试验显示，该方法对鸭腺病毒（DAdV）、番鸭细小病毒（MDPV）、鸭圆环病毒（DuCV）、鸭瘟病毒（DPV）、鸭呼肠孤病毒（DRV）、鸭疫里默氏杆菌（RA）病原无特异性反应，但与鸭甲型肝炎病毒1型（DHAV-1）具有交叉反应，可以同时检测出DHAV-3与DHAV-1病原；应用该试验建立的DAS-ELISA方法与RT-PCR检测方法同时对186份临床样本进行检测，DAS-ELISA方法可同时识别DHAV-1和DHAV-3,且与RT-PCR检测方法的符合率为98.9%。结果表明，本试验建立的DAS-ELISA方法重复性好、灵敏性高，可用于DHAV-1与DHAV-3的诊断，为我国鸭甲型肝炎的流行病学调查及防控提供了技术支撑。