溶血性曼氏杆菌是引起羊呼吸道疾病的重要病原，研制羊源溶血性曼氏杆菌灭活疫苗是防控该病原的有效手段。本研究从某绵羊场采集的病料中分离的溶血性曼氏杆菌，通过小鼠致病性试验筛选出最适制苗菌株，并以4种抗原量(10～6、10～7、10～8、10～9 CFU/mL)与3种佐剂(ISA 201佐剂、ISA 206佐剂、铝佐剂)组合制备灭活疫苗，经免疫和攻毒保护试验，筛选出灭活疫苗制备的最佳抗原量和佐剂。最后，利用筛选出的最佳条件制备疫苗，观察免疫绵羊的抗体水平动态变化。结果显示，共分离得到24株绵羊源溶血性曼氏杆菌，其中血清A1型12株，为该羊场感染的优势血清型；筛选获得1株绵羊源溶血性曼氏杆菌A1型菌株(Mh1)为制苗用菌株，其对小鼠的半数致死量为3.16×10～7 CFU/mL,具有较强的致病性，可造成小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾组织不同程度的炎性细胞浸润等病理损伤；免疫及攻毒保护试验结果显示，灭活疫苗的最佳抗原量为10～9 CFU/mL,最适佐剂为ISA 201,刺激产生的抗体水平最高，对小鼠的保护率达100%,免疫绵羊后可诱导产生良好的体液免疫。结果表明，本研究制备的羊源溶血性曼氏杆菌A1型灭活疫苗具有良好的免疫保护效果，为进一步研发羊源溶血性曼氏杆菌商品化疫苗奠定了良好的基础。