非洲猪瘟病毒I177L基因缺失疫苗是当前非洲猪瘟(African swine fever, ASF)减毒活疫苗研发的重点方向之一。为有效鉴别非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)野毒株和I177L基因缺失株，本试验根据ASFV B646L和I177L基因分别设计特异性引物和探针，经过筛选和优化，建立了双重荧光PCR检测方法。结果显示，该方法特异性强，可同时检测ASFV B646L和I177L基因，与猪圆环病毒2型、塞内卡病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等无交叉反应；灵敏度高，该法对重组质粒pUC57-B646L和pUC-I177L的检出限均为1×10～3拷贝/mL;重复性好，批内和批间变异系数(coefficient of variation,Cv)均小于4%。应用该双重荧光PCR方法和WOAH推荐的荧光PCR法对122份猪肉及猪肉制品进行比对检测，2种方法对B646L基因检测结果符合率为100%,且所建立方法阳性结果均出现2条扩增曲线。本研究建立的方法可用于ASFV I177L基因缺失株检测，为ASF监测和流行病学调查提供了技术支持。