采集猪流感(swine influenza, SI)疑似病猪的鼻拭子样品，经RT-qPCR检测H3亚型猪流感病毒(swine influenza virus, SIV),将阳性样品接种SPF鸡胚进行病毒分离，对分离到的H3N2亚型SIV进行全基因组测序及序列分析，并对其致病性进行研究。结果表明，成功分离到1株SIV,经分型RT-PCR鉴定为H3N2亚型，命名为A/Swine/YunNan/KM/06/2023(H3N2),简称SIV H3N2 KM株。全基因组序列BLSAT比对结果显示，SIV H3N2 KM株的8个节段分别与8个不同毒株的猪源或人源流感病毒的同源性最高，分别为95.41%～97.49%,其中HA和NA节段来源于H3N2亚型SIV,NP节段来源于H1N1亚型人流感病毒，M节段来源于H1N2亚型SIV,其他节段均来源于H1N1亚型SIV。HA蛋白的关键受体位点(190D、223V、226I、228S)未发生改变。致病性试验结果显示，感染组仔猪出现体温升高、喷嚏、流鼻涕等症状，可通过鼻腔向外界排毒，剖检后肺脏产生不同程度的肉样实变，免疫组化结果显示，病毒可在肺脏中大量复制。综上，本试验成功分离到1株H3N2亚型SIV,并对该病毒的基因遗传演化、分子特征和致病性进行了研究，揭示了H3N2亚型SIV在不断地发生演变，分离株对仔猪具有致病力，为我国SIV流行情况的监测和SI防控提供了参考依据，并为SI疫苗研发提供了候选毒株。