伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)能够引起猪只出现以呼吸困难、繁殖障碍和神经系统疾病等为特征的伪狂犬病，在世界范围内传播广泛。2011年以来，新现的PRV变异株导致传统疫苗株的免疫保护效果不佳，且原有的疫苗株制备方法耗时耗力，因此现阶段急需开发一种高效疫苗株筛选的方法。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，设计2条靶向PRV毒力基因TK的单链引导RNA(single guide RNA,sgRNA),敲除PRV变异株CH/JX/2016编码的TK基因，再利用同源修复质粒在TK基因座位置插入增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP),经多轮蚀斑纯化获得rPRV-ΔTK/EGFP毒株。结果表明本研究构建的sgRNA切割效率高，只经过3轮纯化就可完成rPRV-ΔTK/EGFP毒株的制备，且EGFP基因正常表达。CRISPR/Cas9系统能够简便快速高效地编辑PRV基因，在疫苗候选株创制中潜力巨大，而且拯救的rPRV-ΔTK/EGFP毒株不仅可以作为研究PRV变异株感染进程的示踪毒株，还能用于后续抗病毒药物的筛选。