非洲猪瘟是对全球养猪业危害最严重的病毒性传染病，目前尚无有效疫苗。p54蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)的重要结构蛋白之一，参与病毒的吸附和侵入，是非洲猪瘟血清学诊断的重要靶标之一。本研究采用无标签的重组p54蛋白作为包被抗原，建立了ASFV p54间接ELISA抗体检测方法，优化了检测条件，组装成了试剂盒。根据对374份阴性猪血清的检测，确定了本试剂盒检测的临界值，并利用不同猪病原阳性质控血清进行了敏感性、特异性和稳定性研究。结果显示，本方法检测阴/阳性血清的临界值为0.250;敏感性血清质控品的最小检出限为1∶1 600倍，与ASFV阳性血清、猪伪狂犬病病毒阳性血清、猪繁殖与呼吸病毒综合征病毒阳性血清、猪圆环病毒2型阳性血清、猪细小病毒阳性血清和猪抗大肠杆菌阳性血清等6种特异性质控血清均无交叉反应；试制的3批试剂盒批间和批内变异系数均小于10%。试剂盒在2～8℃贮存9个月，特异性、敏感性保持不变。以上试验结果表明，本试剂盒具有良好的敏感性、特异性和稳定性，与OIE推荐的p72阻断ELISA抗体检测试剂盒具有较高符合率，为非洲猪瘟临床血清学诊断和抗体监测提供了良好的技术支持。