旨在构建一种表达牛纽布病毒(bovine nebovirus, BNeV)VP1蛋白的人5型复制缺陷型重组腺病毒rAd5-BNeV＿VP1,并评价其免疫效果。以优化合成的BNeV VP1基因序列构建重组穿梭质粒pDC316-VP1,利用AdMax腺病毒包装系统包装重组腺病毒rAd5-BNeV＿VP1,并在小鼠中评价其免疫效果。结果显示，通过比对国内BNeV VP1氨基酸序列，根据HEK293细胞密码子偏嗜性优化合成国内流行毒株Bo/LN-13/18/CH株的BNeV VP1序列，序列大小为1 650 bp。将pDC316-VP1与骨架载体pBHGIox＿E1,3Cre共转染入HEK293细胞包装出重组腺病毒rAd5-BNeV＿VP1。RT-PCR扩增出1 650 bp的BNeV VP1基因条带，Western blot及间接免疫荧光反应证实rAd5-BNeV＿VP1能够成功表达VP1蛋白，蛋白大小约为57.5 kDa,表明成功包装出rAd5-BNeV＿VP1且VP1基因能在重组腺病毒中稳定表达，其TCID_(50)为10~(-5.34)/0.1 mL。通过肌肉注射和滴鼻2种途径免疫小鼠均能产生较高的特异性抗体水平，二免7 d后肌肉注射组抗体效价最高可达1∶10~5,滴鼻组抗体效价最高可达1∶10~4;滴鼻组可产生高于PBS组2倍的INF-γ和IL-2(P<0.05)。结果表明，本研究构建表达BNeV VP1蛋白的重组腺病毒rAd5-BNeV＿VP1具有良好的免疫原性，可刺激小鼠快速产生针对BNeV VP1的特异性抗体，为今后BNeV疫苗的研发奠定了基础。