根据猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白的CS中和表位区(499～789 aa)序列设计1对特异性引物，在其5′端分别引入BamHⅠ和HindⅢ,PCR扩增PEDV CS区。将扩增的CS片段插入至pBApo-EF1α＿Pur＿DNA真核表达载体的BamHⅠ和HindⅢ位点，然后扩增含CS区表达盒，将其插入至含猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)AD基因的PRV转移质粒pG-AD-EGFP中，构建转移质粒pG-AD-CS-EGFP。利用转染试剂ZLip2000将伪狂犬病病毒(PRV)三基因缺失毒株rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-基因组与转移质粒pG-AD-CS-EGFP共转染ST细胞，获得携带有TGEV AD、PEDV CS区和绿色荧光蛋白标记基因的重组病毒rPRV-AD-CS-EGFP。扩增重组病毒rPRV-AD-CS的表达盒，测序后进行遗传稳定性评价，同时将重组病毒rPRV-AD-CS、亲本株Bartha-K61和PRV强毒株分别接种小鼠，进行安全性评价。将该重组病毒与CRISPR/Cas9-EGFP敲除质粒共转染ST细胞，经3轮病毒空斑纯化获得无绿色荧光标记的重组病毒rPRV-AD-CS。经Western blot和IFA证实rPRV-AD-CS在ST细胞中能表达CS外源蛋白，具有良好的遗传稳定性和安全性。结果表明，成功构建共表达TGEV AD蛋白和PEDV S蛋白CS区的重组病毒株rPRV-AD-CS,该重组病毒具有遗传稳定性和安全性，为开发安全、有效的预防TGEV、PEDV和PRV感染的三联苗奠定基础。