禽腺病毒属成员鸭腺病毒3型(duck adenovirus type 3,DAdV-3)和禽腺病毒4型(fowl adenovirus serotype-4,FAdV-4)是养殖场主要流行的病原，对养禽业造成巨大的经济损失。目前尚未见可同时快速检测这2种病原的双重荧光定量PCR检测方法，本研究基于DAdV-3 GDMM10毒株和FAdV-4 GDMZ毒株Fiber2基因序列比对及遗传进化分析，分别在Fiber2基因保守区设计特异性引物，建立了能同时鉴别临床上常见的DAdV-3和FAdV-4双重荧光定量PCR检测方法。结果表明，DAdV-3 GDMM10和FAdV-4 GDMZ Fiber2基因处于两个不同进化分支上，同源性为46.10%。建立的检测DAdV-3和FAdV-4双重荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高，最低可检出45拷贝/μL的DAdV-3样品和17拷贝/μL的FAdV-4样品；且检测结果可直接通过Tm值差异进行判定，简化操作时间。利用该双重荧光定量PCR方法对2022年度临床上采集的34份肝炎-心包积液疑似样品进行检测，DAdV-3和FAdV-4检出率分别为17.65%和2.94%。为进一步开展禽源DAdV-3和FAdV-4的分子流行病学及共感染致病机制奠定了基础。