为了预防马立克氏病毒(Marek's disease virus, MDV)和新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)混合感染给养禽业造成的危害，本研究以细菌人工染色体(BAC)为基因编辑平台，利用Red同源重组技术，将NDV的F基因整合到MDV双基因缺失毒株Md5 BACΔmeqΔLorf9基因组中，诱导Ⅰ-SceⅠ酶表达，将筛选标记卡那霉素抗性基因敲除，构建重组活载体疫苗候选毒株Md5 BACΔmeqΔLorf9-F。PCR以及限制性片段多态性(RFLP)分析结果显示F基因成功整合到MDV基因组且重组质粒基因组完整；将鉴定正确的重组质粒转染鸡胚成纤维细胞，1周后出现明显的细胞病变，且噬斑大小与亲本毒无明显差异；体外生长曲线结果显示，F基因的插入不影响病毒的体外复制能力。结果表明，本研究正确构建了表达NDV保护性抗原F基因的重组MDV,为研制ND重组MDV活载体疫苗奠定了基础，对NDV和MDV混合感染的防控具有重要意义。