牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV)和阿卡斑病毒(Akabane virus, AKAV)是引起牛发生繁殖障碍性传染病的主要病原。本研究根据BVDV的5′-UTR、IBRV的gB基因和AKAV的S基因设计了3对特异性引物，构建了检测BVDV、IBRV和AKAV的多重PCR方法，并优化反应体系和条件，验证了该方法的特异性和敏感性。结果显示，构建的多重PCR方法对其他牛源病毒无扩增，对BVDV、IBRV和AKAV的最低检测限分别为10~3、10~3和10~(4 )拷贝/μL。对采集的184份临床血清样品进行检测，BVDV、IBRV和AKAV的阳性率分别为18.48%、14.13%和1.63%,BVDV和IBRV 2种病原混合感染的阳性率为3.8%,BVDV和AKAV两种病原混合感染的阳性率为1.63%。该结果与我国出入境检疫行业标准符合率达92%以上，BVDV+IBRV和BVDV+AKAV混合感染的符合率为100%。表明本研究建立的多重PCR检测方法可用于临床样品的检测。BVDV、IBRV和AKAV多重PCR检测方法的建立，为我国牛群BVD、IBR和AKA的检测和流行病学调查提供了一种快捷简便的分子生物学检测方法。