利用非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白不同抗原表位的2株单克隆抗体，1株作为捕获抗体，另1株用辣根过氧化物酶(HRP)标记后作为检测抗体，采用方阵法对ELISA反应条件进行优化，建立了检测ASFV抗原的双抗体夹心ELISA方法。结果显示，该方法中捕获抗体包被质量浓度为1.25 mg/L,酶标单克隆抗体的最适稀释度为1∶4 000。通过试验确定该方法的临界值为0.299,当样品D_(450)值≥0.3,且P/N大于2时，判定为阳性。该双单抗夹心ELISA方法可特异性检测ASFV抗原，其他抗原检测结果均为阴性，特异性强；重复性好，批内和批间变异系数(CV)均小于8%。应用本研究建立的方法与荧光PCR方法同时对225份临床样品进行检测，总符合率为96.89%。结果表明，本研究建立的双抗体夹心ELISA方法可用于ASFV抗原的大量样品检测，为ASF防控提供了技术支持。