[目的]建立超高效液相色谱法（UPLC）测定人血清中万古霉素的浓度，为优化临床用药方案提供依据.[方法]选择经HCLO₄∶ACN=6∶1沉淀蛋白及NaOH液萃取进行血浆样本前处理，以去甲万古霉素为内标，处理色谱柱为Shim-pack GIST-HP C₁₈（150 mm×2.1 mm, 3μm），流动相为甲醇-0.05 mol/L的磷酸二氢钾缓冲溶液，流动速度为0.4 mL/min，柱温40℃，检测波长236 nm，进样量5μL，对延边大学附属医院使用过万古霉素的患者血药浓度进行监测.[结果 ]万古霉素在2.5～80μg/mL质量浓度范围内线性关系良好，回归方程为Y=0.050 4X+0.001 9（r²=0.999 9），定量下限为2.5μg/mL.准确度、日间、日内精密度、基质效应、方法回收率和稳定性均符合要求.采用该方法对患者进行血药浓度监测，血药浓度达标率显著升高.[结论 ]所建立的UPLC测定万古霉素血药浓度操作简便，快速，专属性好，准确度高，重现性好，稳定性强，适用于临床测定万古霉素血药浓度，可为患者制定个体化方案提供参考.