[目的]本文旨在对一种与奶牛繁殖障碍疾病有关的国内新发病原牛疱疹病毒4型（BoHV-4）进行检测、分离与鉴定。[方法]采集我国东北地区某养牛场疑似发生BoHV-4感染牛的生殖道拭子，将阳性样本接种HeLa细胞分离病毒，通过特异性qPCR、间接免疫荧光（IFA）及电镜观察等方法对分离病毒进行鉴定，并测定病毒一步生长曲线。用PCR扩增病毒gB和TK基因并进行遗传进化分析。[结果]阳性样本接种细胞后盲传3代，能够产生圆缩、聚集等疱疹病毒典型细胞病变效应（CPE）,从IFA结果观察到感染病毒的细胞中出现明显的特异性绿色荧光，电镜观察感染细胞可见直径100～150 nm的病毒粒子，衣壳和囊膜结构清晰，将该毒株命名为TL01。其生长曲线显示在感染后36 h达到峰值(10^6.3TCID₅₀·mL^-1)。PCR扩增病毒gB和TK基因并对其序列进行遗传进化分析，发现TL01的gB基因与参考株DN599在同一分支，属于基因2型；TL01的TK基因与参考株Movar33/63同属于基因1型。[结论]本研究成功分离出1株BoHV-4毒株，为深入研究BoHV-4的生物学特性和流行病学提供参考。