[目的]本文旨在制备日本脑炎病毒（JEV）prM蛋白的单克隆抗体，为进一步了解prM的结构和功能、建立特异性检测方法以及研究JEV prM蛋白功能奠定基础。[方法]将prm基因克隆至原核表达载体pET-32a,诱导表达并纯化prM蛋白，随后将其免疫小鼠，通过细胞融合和亚克隆得到分泌抗prM单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备腹水并进行效价测定，通过Western blot和IFA验证其特异性，并进行空斑中和试验测定其中和活性，利用原核表达多段截短体蛋白确定单克隆抗体抗原表位并进行保守性分析，将其初步应用于感染检测及亚细胞定位分析。[结果]经细胞融合和3次亚克隆后成功获得1株能稳定分泌抗prM单克隆抗体（mAb）的细胞株，命名为4H6,所制备的腹水效价可达到1∶1 638 400,经鉴定，该prM mAb重链属于IgG2b,轻链为κ型。Western blot以及IFA试验均证明该抗体具有良好的特异性。空斑减少中和试验显示prM 4H6分泌的mAb不具备中和活性。通过表达截短蛋白鉴定出prM 4H6分泌的mAb所识别的抗原表位位于³⁰GENRCWVRAIDVGYMC⁴⁵,结合生物信息学分析发现，该表位位于prM蛋白表面且在JEV不同毒株之间高度保守。成功将prM 4H6分泌mAb初步应用于JEV感染检测及prM蛋白的亚细胞定位分析。[结论]成功制备1株高效分泌抗JEV prM蛋白单克隆抗体细胞株，其分泌的特异性mAb的B细胞表位识别区位于pr表面，为分析prM蛋白在病毒复制过程中的生物学功能以及与其他病毒蛋白（如E蛋白或宿主分子）之间的相互作用提供有效工具。