[目的]本文旨在研究土壤宏基因组来源的新型四环素破坏酶Tet(64)的耐药机制并分析tet(64)的基因环境，为tet(64)基因的传播及抗生素和佐剂的研发奠定基础。[方法]利用体外生化反应验证Tet(64)降解四环素的功能，通过液相色谱-质谱联用(LC-MS)分析降解产物，结合序列比对、系统发育树构建、分子对接等生物信息学方法推测Tet(64)中与四环素结合的重要氨基酸残基，解析Tet(64)的耐药机制和tet(64)基因的水平转移风险。[结果]MQ776克隆的序列分析发现tet(64)上游存在IS1插入序列，暗示tet(64)基因具有潜在的水平转移风险。Tet(64)属于黄素依赖型单加氧酶，与首次发现的四环素破坏酶Tet(X)仅有18.93%的序列一致性，与最近发现的一系列土壤来源四环素破坏酶Tet(47)—Tet(56)也只有70%左右的序列一致性。SWISS-MODEL三维建模发现Tet(64)与土壤来源的Tet(50)具有相似的结构，包含1个四环素结合域、1个FAD结合域以及连接上述2个结构域的2个α-螺旋。体外生化试验发现Tet(64)降解四环素后产生了2个特异产物，m/z均为461.0,与Tet(X)催化产物一致。推测反应中四环素C11a位点被羟基化，破坏了C11和C12组成的β-二酮区域，导致四环素不能螯合镁离子而失去抗菌活性。[结论]鉴定了土壤来源的新型四环素破坏酶Tet(64)的四环素降解功能，初步解析了Tet(64)的耐药机制。