[目的]本试验旨在探究日粮添加尿素对育肥湖羊空肠发酵、菌群结构以及氨和尿素转运蛋白表达的影响。[方法]将42只3月龄育肥公湖羊(约24.3 kg)随机均分为3个处理组，在饲喂基础日粮的基础上分别添加0 g·kg~(-1)(U0组)、10 g·kg~(-1)(U10组)、30 g·kg~(-1)(U30组)尿素。试验预饲期1周，正试期10周。试验结束每组随机选取6只屠宰，采集空肠内容物，测定发酵参数和定量总菌，并利用Illumina MiSeq测序分析空肠细菌组成；采集空肠上皮组织样品检测氨转运蛋白b(Rhbg)、氨转运蛋白c(Rhcg)和尿素转运蛋白B(UT-B)基因mRNA表达。[结果]与U0组相比，U10和U30组空肠氨态氮含量显著升高(P<0.05)。与U0组相比，U10组总挥发性脂肪酸和乙酸含量显著降低，U30组丁酸和异戊酸含量相较于U10组显著升高(P<0.05)。相较于U0组，U10和U30组的总菌数量显著升高(P<0.05)。Illumina-MiSeq测序结果显示，添加尿素并未影响空肠Chao 1、ACE、Shannon和Simpson指数(P>0.05),PCoA分析结果显示各组间空肠细菌群落组成明显区分。添加尿素对湖羊空肠中细菌门水平相对丰度无显著影响，但细菌属水平相对丰度存在差异。各处理组主要优势菌属为Lachnospiraceae NK3A20 group、Ruminococcus 2、Acetitomaculum和Bifidobacteriaceae unclassified,其中Lachnospiraceae NK3A20 group和Ruminococcus 2的相对丰度均在U10组中最高。此外，U10组Ruminococcus gauvreauii group和Olsenella的相对丰度相较于U30组显著升高(P<0.05)。与U0和U30组相比，U10组空肠上皮Rhbg基因mRNA表达水平显著上调(P<0.05);Rhcg基因和UT-B基因表达水平随尿素添加水平的升高逐渐降低，但差异不显著(P>0.05)。[结论]日粮补充适宜尿素(10 g·kg~(-1))可提高空肠内氨态氮含量，促进氮利用细菌的生长定殖，改善菌群结构。此外，添加尿素会影响空肠上皮Rhbg基因的表达，但不影响Rhcg基因和UT-B基因的表达。