建立一种基于逆转录-重组酶聚合酶等温扩增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification, RT-RAA)及CRISPR Cas13a技术检测猪A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)的快速检测方法。根据猪SVA保守基因序列设计8对RT-RAA引物，筛选最适扩增引物、最佳反应温度、最优RT-RAA反应体系。针对优化的RT-RAA体系设计并筛选最佳CRISPR-derived RNA(crRNA),构建最优RT-RAA-CRISPR反应体系。利用6种常见猪群病原核酸验证已建立方法特异性。用数字PCR标定的SVA cRNA标准品验证已建立方法敏感性。通过重复试验验证方法的稳定性。应用已建立的方法与临床样品进行符合检验。RT-RAA及CRISPR反应体系优化结果显示，RT-RAA反应温度为37℃,扩增效果最佳；从8条crRNA中筛选出crRNA 5检测信号最强。建立的RT-RAA-CRISPR Cas13a方法特异性好，与ASFV、PRRSV、PEDV、PCV2、CSFV、PRV等常见猪群疫病均无交叉反应；方法敏感性高，对SVA最低检测限为0.86 copy/μL;对3个稀释度标准品检测均能稳定产生荧光，重复性好；能够在50 min内完成临床样品检测，对临床检毕的6份阳性样品及58份阴性样品进行符合检测，结果表明检测结果一致，符合率100%。结果表明，本研究建立了一种高特异性、高敏感性的RT-RAA-CRISPR Cas13a检测方法，有望应用于SVA的现场快速检测。

猪氨肽酶N（porcine aminopeptidase N,pAPN）是一种锌金属蛋白酶，介导病毒与宿主细胞融合，是冠状病毒的细胞受体之一。为探究pAPN对猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）复制的影响，本研究从小肠组织中扩增出pAPN基因全长，通过限制性内切酶同源位点克隆到慢病毒载体中，获得携带pAPN基因的慢病毒载体PLVX-pAPN-mCMV-ZsGreen1-puro,在293T细胞中包装形成表达pAPN的慢病毒，将慢病毒感染Vero细胞，用嘌呤霉素加压筛选阳性细胞，采用有限稀释法筛选出稳定表达的Vero-pAPN细胞系，并通过测定N基因mRNA转录水平、N蛋白表达水平和TCID₅₀水平差异情况来验证该细胞系对PEDV复制的影响。结果显示，本研究构建的慢病毒能够感染Vero细胞，亚克隆筛选到的单克隆细胞株Vero-pAPN（2C5）能够稳定过表达pAPN;该细胞系能够促进PEDV复制，在12～48 h内N基因mRNA转录水平差异显著（P<0.05）、N蛋白表达水平均提高，TCID₅₀在24和48 h差异显著（P<0.05）。本研究构建了Vero-pAPN细胞系，pAPN在Vero细胞中过表达能够促进PEDV复制，该细胞系可作为疫苗高效生产和临床样本分离的候选细胞系。

2022年12月至2023年12月期间，在全国采集2 560份拭子样品，利用PCR方法对猫博卡病毒(feline bocavirus, FBoV)进行检测并扩增其NS1及VP2基因编码序列；同时，利用生物信息学方法分析FBoV的遗传多样性。结果显示，FBoV的总阳性率为4.6%(119/2 560),共在8个省或直辖市的样品中检出FBoV,疾病呈区域性流行特点；基因遗传进化分析结果显示，FBoV以多种基因型存在，我国主要以FBoV-1型流行为主，本研究鉴定的15株FBoV-1型毒株、4株FBoV-2型毒株、1株FBoV-3型毒株与中国、美国、泰国、澳大利亚、葡萄牙所鉴定的毒株遗传距离较近；同源性分析结果显示，各测序毒株与参考毒株间NS1及VP2基因氨基酸同源性分别为60.40%～99.20%和67.20%～100%,各测序毒株之间NS1及VP2氨基酸同源性分别为60.60%～100%和67.80%～100%,结果表明，我国流行的FBoV毒株具有明显的遗传多样性。本研究为阐明我国FBoV的流行现状充实了资料，并为后续针对FBoV的诊断或防控提供了流行病学调查基础。

禽传染性支气管炎(infectious bronchitis, IB)是由禽传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)引起鸡的一种急性、高度接触性传染病，IBV变异程度高，现有的免疫手段常无法达到良好的效果，严重影响国内养禽业的发展。通过对IBV的非特异性免疫、黏膜免疫以及特异性免疫等3个方面现阶段免疫应答分子机制的综述，以期为IBV免疫机制的研究提供理论参考。

运用生物信息技术分析FliC_EcN的结构和潜在的抗原表位；借助ClonExpress^?同源重组技术设计引物，缺失FliC_EcN高变区不同结构域，并克隆至pET-28a（+）表达载体中表达，经SDS-PAGE和Western blot鉴定鞭毛蛋白变体；采用鲎试剂显色法检测鞭毛蛋白变体中内毒素残留，并使用不同质量浓度的鞭毛蛋白变体刺激Caco-2细胞，通过检测IL-8的分泌水平来评估各鞭毛蛋白变体的生物学活性。生物信息分析结果显示，FliC_EcN高变区的多数结构域被预测为含有潜在的抗原表位；PCR结果显示，fliC_{△820～1 518}、fliC_△736～963、fliC_{△985～1 200}、fliC_△748～828、fliC_{△1 114～1 191}和fliC_{△1 225～1 311}分别约为1 095、1 566、1 578、1 713、1 716、1 707 bp; SDS-PAGE结果显示，经镍柱纯化处理和透析复性的鞭毛蛋白变体分别约为41.36、57.06、57.50、61.97、61.95、61.56 kDa; Western blot结果显示，6个鞭毛蛋白变体均能与抗His单克隆抗体和大肠杆菌H7抗原诊断血清发生特异性反应；TLR5活性检测结果显示，缺失不同结构域的鞭毛蛋白变体保留了其TLR5激动剂功能。结果表明，本试验成功构建了6种FliC_EcN缺失高变区不同结构域的鞭毛蛋白变体，且各鞭毛蛋白变体均保留了其TLR5激动剂功能，展现了良好的生物学特性，为进一步研究鞭毛蛋白在缺失不同结构域后的佐剂效应以及鞭毛蛋白抗体滴度对其佐剂效应影响提供了参考依据。

旨在建立一种检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的重组酶介导等温核酸扩增(recombinase aided amplification,RAA)技术方法。基于对PEDV基因组的分析,筛选M基因的特异性序列作为检测靶标,设计扩增效率高、特异性好的RAA引物对和探针,通过荧光恒温检测仪实时监控扩增过程,结合免核酸提取技术,实现对PEDV核酸的快速、敏感和特异检测。结果表明,该方法具有较好的敏感性,最低检测限为8.86×10～1拷贝/μL;同时,该检测方法具有良好的特异性和重复性,不与猪传染性胃肠炎病毒、猪冠状病毒、猪圆环病毒等发生交叉反应。在37～41℃的恒温条件下,扩增曲线明显,表明该方法具有良好的温度适应性。本研究成功建立了检测PEDV的荧光RAA技术方法,有望用于PEDV的现场快速检测。

从污水中分离出1株沙门菌裂解性噬菌体PJN025,测定其生物学特性和全基因组序列，并评估其在动物感染模型中的治疗潜力。透射电镜观测结果显示，其属于Caudoviricetes科。PJN025仅裂解鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌，潜伏期约10 min,暴发期80 min,暴发量约为132 PFU/细胞，表明噬菌体能够高效杀菌；噬菌体的稳定性良好，在30～70℃之间和pH3～12范围内保持稳定。全基因组测序显示，该噬菌体基因组全长为46 478 bp, G+C含量为45.9%,包含82个开放阅读框和1个tRNA,未检测到已知的毒力基因或耐药基因。使用足部注射的方式对大蜡螟幼虫进行鼠伤寒沙门菌的攻毒，48 h时细菌攻毒的阳性对照组的存活率是5%,使用1×10～8 PFU/mL的PJN025噬菌体后，预防组的疗效最好，存活率可提高至70%;使用腹腔注射的方式对SPF小鼠进行鼠伤寒沙门菌的攻毒，5 d时细菌攻毒的阳性对照组中的小鼠全部死亡，使用1×10～8 PFU/mL的PJN025噬菌体后，共感染组的疗效最好，存活率可提高至60%,表明噬菌体的使用能够提高受试动物的存活率。结果表明，噬菌体PJN025特异性强、裂解效率高、对酸碱耐受性较好、耐热性强，安全性和预防效果好，为后续噬菌体产品的研制提供了材料和实验基础。

收集免疫反应较强的中间宿主羊细粒棘球绦虫感染阳性血清，以健康血清为阴性对照，纯化该血清与靶标蛋白经免疫沉淀捕获和富集相应的抗原，获得靶标蛋白-抗体-目的蛋白复合物。联合质谱策略筛选与鉴定细粒棘球绦虫相关特异性抗原，利用在线预测软件对肽段覆盖率最高的蛋白进行生物信息学分析。结果显示，IP-MS鉴定得到133种细粒棘球绦虫相关蛋白，其中肽段覆盖率≥70%的有1种蛋白，为肌动蛋白；肽段覆盖率为30%～40%的有3种蛋白，分别为含Ton B结构域蛋白、NADH脱氢酶(泛醌)1 α亚复合物2、乳酸脱氢酶；肽段覆盖率为20%～30%的有6种蛋白，分别为剪接因子3b亚基5、肿瘤蛋白D52、表达的保守蛋白、NADH脱氢酶(泛醌)1α亚复合物7、肌苷-5′-单磷酸脱氢酶和醛酮还原酶家族1成员B4。生物信息学分析显示，肌动蛋白无信号肽，可能为非分泌型蛋白，亚细胞定位在细胞骨架，存在6个最佳潜在抗原表位，二级结构和三级结构一致以α螺旋和无规则卷曲为主。结果表明，免疫沉淀-质普联用技术是筛选和鉴定细粒棘球绦虫抗原的一种高通量、简便、快速有效的方法，可为筛选中间宿主羊血清诊断标识的特异分子及包虫病新型诊断技术的研发提供依据。

为预测草原革蜱在新疆地区的分布点和适生区情况及了解其实验室条件下生活周期史，本研究使用最大熵(maximum entropy modeling, MaxEnt)模型对草原革蜱在新疆地区的地理分布以及适应区进行预测，并使用刀切法(jackknife test)及环境变量响应曲线评估影响草原革蜱分布的环境因子。根据预测的地点随机采集革蜱样本，利用形态学特征及分子生物学相结合方法鉴定革蜱种类。以新西兰大白兔为唯一供血动物，在实验室自然光照条件下采用耳套饲养法进行人工饲养，观察记录该蜱的生活史周期及生物学特性。使用刀切法检验及SPSS分析结果显示，影响草原革蜱适生区分布的主要环境变量因子为平均温度(Bio1)、均气温日较差(Bio2)、温度季节性变化(Bio4)、最干旱月降水量(Bio14)、降水量变异系数(Bio15)、最冷季度降水量(Bio19)。主要环境变量因子响应曲线结果显示，草原革蜱在Bio1为15.58℃、Bio2为6.19℃、Bio4的变异系数为1 500、Bio14为20 mm、Bio15的变异系数为23.799、Bio19为69 mm时存在概率最大。适生区预测结果显示，新疆草原革蜱适生区为准噶尔盆地、天山山脉及山间谷地、阿尔泰山、吐鲁番盆地、以及天山山脉以南部分地区，占新疆总面积的50.99%。根据MaxEnt模型预测地区采集革蜱，通过形态学结合分子生物学方法鉴定为草原革蜱；幼蜱饱血期为5.31 d,蜕化期为8.19 d,蜕化率达到95.5%;若蜱饱血期为8.65 d,蜕化期为12.86 d,蜕化率达到98%;成蜱饱血期为6.75 d,饱血雌蜱产卵前期为5.86 d,饱血雌蜱产卵期为12.5 d;蜱卵经25.92 d孵化为幼蜱，孵化率达到90%;草原革蜱在实验室条件下完成一个生活史需62～10 d,平均需86.0 d。所构建的MaxEnt模型具有较高的预测精度和准确性，根据主要环境因子变量分析，降水量和温度是影响草原革蜱的主要环境因子。本试验研究为新疆优势蜱种-草原革蜱的危害评估、建立实验室人工饲养纯种蜱体系及当地蜱传疾病的综合防控奠定了基础。

为了制备猪流行性腹泻病毒(procine epidemic diarrhea virus,PEDV) S1蛋白的单克隆抗体,本研究首先利用大肠杆菌表达系统和亲和层析法成功获得纯化的重组PEDV S1蛋白,免疫BALB/c小鼠后利用杂交瘤技术和间接ELISA方法制备并筛选阳性的杂交瘤细胞,最后利用体内诱生法制备腹水抗体。ELISA结果显示筛选到抗PEDV S1单克隆抗体的杂交瘤细胞株共有4株,并将其命名为E6、G3、H6、F2。4株杂交瘤细胞上清效价都达到1:6 400,选择抗体效价高、抗体分泌更稳定的单克隆抗体H6进行抗体类型鉴定,发现单抗H6为IgG1亚类,轻链为λ链,诱生小鼠腹水的抗体效价为1:10～6且与其他蛋白无交叉反应;Western blot结果显示单抗与重组S1蛋白PEDV QY2016和PEDV CV777毒株均在38 kDa处出现特异性条带;IFA结果也同时发现单抗与感染PEDV QY2016和PEDV CV777毒株的细胞反应出现绿色荧光信号;单克隆抗体H6的亲和常数为K=1.75×10～7 mol/L,说明H6株具有良好的亲和性,可用于后续诊断抗体的开发。综上,本研究成功制备了能够特异性识别PEDV S1蛋白的单克隆抗体,该抗体可用于PEDV的抗原检测,为PEDV检测方法的研究提供了重要试验材料。

近年来，由冠状病毒引起的疫病呈现频发、暴发和新发的趋势，造成人类和动物严重的呼吸和消化系统疾病，危害全球公共卫生安全和畜禽健康养殖。目前，对冠状病毒致病、跨种传播等机制的认识不足制约了抗冠状病毒药物和疫苗产品的研制。反向遗传操作技术可用于病毒蛋白功能和病毒致病、复制机制的解析，也是减毒、基因标记疫苗和抗病毒药物研发中不可或缺的技术工具。因冠状病毒因基因组较大、结构复杂，其反向遗传操作技术曾长期发展滞后，但是随着分子生物学手段的不断更新，多种新的构建策略应运而生。通过重点介绍冠状病毒反向遗传操作系统的构建策略及其在冠状病毒传播、致病机制、疫苗研发和药物筛选中的应用，为冠状病毒感染的防控提供有利的工具。

为调查化脓隐秘杆菌在奶山羊乳房炎中的分布及其生物学特性，本研究从陕西省关中地区9个奶山羊养殖场中采集67份患乳房炎的奶山羊乳汁样品，经细菌分离培养获得21株化脓隐秘杆菌。对21株分离菌进行8种毒力基因PCR扩增，使用微量肉汤稀释法检测21株分离菌对10种抗菌药物的敏感性，利用Illumina NovaSeq 6000二代测序技术对选取的9株分离菌进行基因组测序，最后将分离菌经乳导管接种小鼠后验证其致病性。毒力基因检测结果显示，21株分离菌中plo、cbpA、nanH、nanp、fimA、fimC、fimE基因的阳性率分别为100.0%、38.1%、52.6%、31.6%、61.9%、57.1%和52.4%,而fimG基因均未检出，该结果与二代测序基因组比对结果一致。药物敏感性试验结果显示，分离菌对克林霉素(CLI)、头孢噻呋(CEF)和万古霉素(VAN)的敏感率为100.0%,对青霉素(PEN)、红霉素(ERY)、磺胺异噁唑(SXT)、氟苯尼考(FFC)、四环素(TE)、庆大霉素(GEN)和恩诺沙星(ENR)的耐药率分别为76.2%、52.1%、52.4%、52.4%、47.6%、42.9%和33.3%,其中至少对3种抗菌药物耐药的菌株比例为71.4%(15/21);使用ResFinder对耐药基因比对分析发现，9株分离菌株基因组包含8种耐药基因，分别是介导氨基糖苷类抗生素耐药的ant(2'')-Ia和ant(3'')-Ia、介导氯霉素类抗生素耐药的cmlA1和cmx、介导大环内脂类抗生素的erm(X)和lnu(A)、介导磺胺类抗生素耐药的sul1和介导四环素类抗生素耐药的tet(W),其中除tet(W)、cmlA和erm(X)外，此前，国内化脓隐秘杆菌分离株中尚未见其他耐药基因的相关报道。动物致病性试验中，小鼠接种分离菌后24 h出现乳腺红肿、充血、腺体组织炎性细胞浸润等现象，表明分离菌对小鼠乳腺组织有致病力。本研究针对奶山羊乳房炎源化脓隐秘杆菌的生物学特性及致病性开展初步研究，丰富了其耐药性及基因组数据，为奶山羊规模化养殖过程中化脓隐秘杆菌病的防治提供了参考依据和用药指导。

为探究泛素特异性蛋白酶47(ubiquitin-specific protease 47,USP47)对狂犬病病毒(rabies virus, RABV)感染小鼠神经母细胞瘤细胞(Neuro-2a, N2a)的影响，本研究通过RT-qPCR、免疫印记和病毒滴度测定等技术，检测在N2a细胞中，RABV直接感染对USP47表达水平的影响，然后检测过表达USP47及敲低USP47后RABV核蛋白和磷蛋白基因水平、蛋白水平和上清液病毒滴度的变化。结果显示，RABV感染会引起N2a细胞中USP47转录水平上调。过表达USP47后，RABV N和RABV P基因和蛋白表达水平均上升，上清中病毒滴度也随之升高，同时白细胞介素6(IL-6)基因水平降低；敲低USP47后，RABV N和RABV P基因和蛋白表达水平降低，上清中病毒滴度也相应降低，IL-6基因水平升高。结果表明，USP47可促进RABV感染，抑制IL-6的表达。这一发现为深入研究USP47调控RABV感染的分子机制打下了基础。

载脂蛋白D(apolipoprotein D,APOD)广泛存在于动物各组织,参与机体的生殖调控。为探究APOD在双峰驼附睾中的表达规律及其对精子成熟的调控作用,本试验以发情期及乏情期双峰驼附睾为材料,首先克隆APOD的编码序列(CDS)区全序列,利用ProParam、SOPMA、SWISS-MODEL和MEGA7.0等软件分析其理化特性,同时采用qRT-PCR、蛋白免疫印迹(Western blot)及免疫组织化学法(IHC)检测APOD在附睾中的表达及分布规律。克隆结果显示,APOD基因的CDS区长度为624 bp,编码207个氨基酸,双峰驼APOD序列与羊驼的核苷酸和氨基酸序列存在高度保守性,同源性近,与麋鹿的同源性最低。qRT-PCR结果显示,乏情期附睾头、体及尾APOD的mRNA水平显著高于发情期(P<0.01);Western blot结果显示,乏情期附睾头及附睾体的APOD蛋白表达与mRNA表达趋势相似,但乏情期附睾尾APOD的表达水平与mRNA表达水平相反(P<0.05)。H&E及IHC结果显示,发情期和乏情期附睾组织有明显差异,且APOD在附睾上皮细胞、平滑肌细胞、精子及结缔组织均有不同程度的阳性反应。结果提示APOD可能参与发情期及乏情期精子的成熟过程,为进一步探究APOD参与季节性发情的调控机制提供依据。

为实现同时检测bla_NDM、mcr-1和cfr 3种耐药基因的方法。通过构建质粒标准品、对引物及探针设计和优化反应体系及条件，成功建立bla_NDM、mcr-1和cfr三重荧光定量PCR检测方法。该方法能特异性地检出bla_NDM、mcr-1和cfr,而对其他耐药基因均不能检出；3个耐药基因标准曲线的相关系数（R²）均大于0.999,变异系数（Cv）均低于1%;质粒标准品最低检出限值均为10～2 copies/μL。使用建立的方法对800份细菌样本进行检测，结果显示，含耐药基因mcr-1样本32份、只含耐药基因bla_NDM样本40份、只含耐药基因cfr样本2份；同时含有耐药基因mcr-1和bla_NDM的样本8份，未检出同时携带3种耐药基因的细菌样本。以上结果证实，本研究建立的三重荧光定量PCR方法具有灵敏性高、特异性强及稳定性好的优点，适用于临床上快速检测bla_NDM、mcr-1和cfr 3种耐药基因，为细菌多重耐药基因的检测和控制提供技术支持。

为了鉴别临床上以繁殖障碍及流产为特征的病毒性疫病，本研究建立了同时检测猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和非洲猪瘟病毒（ASFV）的四重qPCR方法，根据NCBI基因库中4种病毒保守基因设计4对特异性引物和探针，对反应的退火温度、引物浓度和探针浓度进行优化，并检验该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示：该方法不能检测到除目的病原以外的其他病原；对PRV、PPV、PCV2和ASFV 4种病原的最低检测限均为10拷贝；组内和组间重复性试验显示不同批次试验间C_t值变异系数均小于3%,说明该方法具有高度特异性、敏感性和稳定性。以上试验结果证明，本研究建立了高效灵敏的四重qPCR方法，为临床上猪伪狂犬病毒病、猪圆环病毒病、猪细小病毒病和非洲猪瘟的防控提供技术参考。

冠状病毒是迄今已知的基因组最大的RNA病毒，其中猪冠状病毒是引起仔猪急剧腹泻的重要病原体，具有高度变异特性，防控难度较高，每年给我国养猪业带来严重的经济损失。对冠状病毒RNA合成机制的解析有助于了解冠状病毒的遗传变异规律和筛选抗病毒药物，目前研究较深入的主要是鼠冠状病毒(murine coronavirus, MHV)和2型人严重呼吸道综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)。为探究猪冠状病毒的复制机制，本研究以MHV和SARS-CoV-2等冠状病毒为参考，总结了其与猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus, SADS-CoV)等猪冠状病毒非编码区调控病毒复制的机制。重点分析5′非编码区(5′untranslated region, 5′UTR)的保守基序及二级结构在病毒复制中的作用、3′UTR的保守结构如何调控病毒复制、病毒非编码区与宿主蛋白的相互作用调控病毒复制以及病毒非编码区变异特征等内容，为针对该类靶点的抗病毒药物和高病毒滴度疫苗候选株的开发提供理论基础。

为构建表达鹅星状病毒基因2型(GoAstV-2)衣壳蛋白(Cap)的重组禽腺病毒4型(FAdV-4),本研究将GoAstV-2的Cap基因表达盒插入到含有FAdV-4感染性克隆p15A-cm-FAdV4-HNJZ中FAdV4基因组的1 966 bp自然缺失区，将获得的重组感染性克隆p15A-cm-FAdV4-HNJZ-Cap/GoAstV-2利用限制性内切酶线性化后转染鸡肝癌细胞系(chicken hepatoma cell line, LMH),拯救出表达Cap蛋白的重组病毒rFAdV4-Cap/GoAstV-2。将重组病毒在LMH细胞中连续传至第15代，提取重组病毒基因组DNA,用插入位点两侧的鉴定引物进行PCR和利用抗Cap蛋白多克隆抗体进行间接免疫荧光试验和Western blot对重组病毒进行鉴定，同时对重组病毒在LMH细胞中的复制动态进行了研究。结果显示，GoAstV-2的Cap基因能够稳定存在于重组病毒rFAdV4-Cap/GoAstV-2基因组中，而且获得稳定表达；重组病毒具有良好的体外复制能力。本研究所制备的重组病毒rFAdV4-Cap/GoAstV-2为研制防控鹅FAdV-4和GoAstV-2混合感染的新型高效二联灭活疫苗奠定了基础。

基于核因子E2相关因子2（Nrf2）/谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）信号通路研究槲皮素抑制玉米赤霉烯酮（zearalenone, ZEN）诱导IPEC-J2猪小肠上皮细胞铁死亡的作用机制。体外培养IPEC-J2细胞，ZEN处理（25mg/L）的同时给予不同浓度槲皮素干预（10、20、40μmol/L）。生化法检测各组细胞培养液上清中乳酸脱氢酶（LDH）、总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）水平；荧光探针检测细胞中Fe²⁺、活性氧（ROS）和脂质过氧化水平；Western blot检测Nrf2、长链酯酰辅酶A合成酶4（ACSL4）和GPX4蛋白表达水平。将IPEC-J2细胞分为对照组、ZEN组、槲皮素组和ML385（Nrf2抑制剂）+槲皮素组，除对照组外其余各组均接受ZEN处理，并采用槲皮素和ML385进行干预，检测Nrf2/GPX4通路相关蛋白表达和铁死亡指标(LDH、Fe²⁺、MDA和GSH)变化。结果显示，与对照组比较，ZEN组细胞存活率、T-AOC及GSH、SOD水平、Nrf2和GPX4蛋白表达降低（P<0.05）,细胞LDH释放率、Fe²⁺及ROS、脂质过氧化、MDA水平及ACSL4蛋白表达升高（P<0.05）。与ZEN组比较，槲皮素组细胞存活率、细胞T-AOC、SOD及GSH水平、Nrf2和GPX4蛋白表达升高（P<0.05）,细胞LDH释放率、Fe²⁺及ROS、脂质过氧化、MDA水平及ACSL4蛋白表达降低（P<0.05）。与槲皮素组比较，ML385+槲皮素组细胞Nrf2及GPX4蛋白表达和GSH水平降低（P<0.05）,细胞LDH释放率、Fe²⁺及MDA水平升高（P<0.05）。综上，槲皮素能够抑制ZEN诱导的IPEC-J2细胞铁死亡，其作用机制可能与其激活Nrf2/GPX4信号通路有关。

为建立牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)血清学检测方法，本试验对BPIV3的HN、NP、F、P蛋白进行原核表达、纯化，筛选最适蛋白包被抗原，建立间接ELISA检测方法。结果显示，成功表达了BPIV3的4种重组蛋白rHN、rNP、rF和rP;棋盘滴定结果显示，rHN蛋白作为包被蛋白具有最高的P/N值，因此用于后续方法建立。摸索间接ELISA的最适反应条件：抗原包被质量浓度为0.5 mg/L,37℃1.5 h; 5%脱脂牛奶，4℃过夜封闭；血清1∶50稀释，37℃孵育1 h;二抗稀释度为1∶10 000,37℃孵育0.5 h;底物反应条件为37℃12 min。特异性试验结果显示，所建立的方法能够特异性识别BPIV3抗体阳性血清，且灵敏度达到1∶800,批内与批间重复性的检测中变异系数均小于10%,与SVANOVIR试剂盒检测同一批样品的总符合率为92.22%。应用该方法对河北地区192份血清样品进行检测，血清中BPIV3抗体阳性率为66.15%。结果表明，本试验构建的BPIV3抗体间接ELISA检测方法适用于临床大规模血清学调查。

为探究不同失血时间对犬失血性休克（hemorrhagic shock,HS）复苏后肝肾功能、血乳酸（Lac）及氧化应激指标的影响,将10只健康中华田园犬随机分为失血1.5 h复苏组（HSR_A组）和失血3.5 h复苏组（HSR_B组）。于复苏后2、6、24、48及72 h检测肝肾功能、Lac、氧化应激相关指标的变化。结果显示,HSR_B组在复苏后各个时间点的肝功能指标总胆红素（TBIL）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）均高于HSR_A组;2组犬肾功能指标无显著变化;HSR_B组Lac水平在复苏后2、6 h显著高于HSRA组;HSR_B组CAT活性在复苏后2 h显著低于HSR_A组,HSR_B组GSH-px活性在复苏后2、6、24 h显著低于HSR_A组,HSR_B组SOD活性在复苏后24 h显著低于HSR_A组,HSR_B组MDA含量在复苏后2、6、24、48 h显著高于HSR_A组。结果表明,HS复苏后可引起肝损伤及氧化应激反应,且随着失血时间延长,犬的肝损伤及氧化应激损伤程度加重。

基于数据挖掘和网络药理学方法,分析探讨治疗脓毒症的中药复方用药规律以及核心药物的分子作用机制。首先通过搜索PubMed数据库、Web of Science数据库和中国知网(CNKI)自建库至2024年4月30日的中医药治疗脓毒症的相关文献。再对处方进行药物频次、关联分析的统计分析,得到核心药物。然后通过TCMSP等数据库平台筛选核心药物有效活性成分,在GeneCards等数据库中获得脓毒症相关基因,并统计出交集靶点,将交集靶点进行PPI分析、GO功能和KEGG通路富集分析预测核心中药的作用机制。最后,通过分子对接法反向检验关键靶点和中药成分的关系。结果显示,筛选得到64首复方,共150味中药,这些中药多味甘,性寒,归脾经、胃经和肠经,根据关联规则筛选出核心药物为“芒硝-桃仁-大黄”。核心药物与脓毒症的交集靶点79个,核心靶点为IL-1β、EGFR和SRC等。涉及MAPK、TNF和IL-17等信号通路,介导炎症反应、细胞凋亡等生物过程,发挥对脓毒症的治疗作用。分子对接结果表示,关键靶点与药物主要成分的对接活性较好,其中番泻苷E与SRC具有最低的结合能,对接活性最好。综上,本研究结果表明中医药治疗脓毒症处方用药多以补脾、清热为主,核心药“芒硝-桃仁-大黄”治疗脓毒症作用机制是多层次、多角度的,为中药治疗脓毒症提供了一定的理论依据。

本研究研发了一种基于重组酶介导核酸扩增(RAA)技术结合胶体金试纸条快速检测牛肠道病毒(BEV)的方法。以高度保守的BEV 5′UTR作为靶序列，设计出特异性引物，下游引物5′端标记生物素，探针5′端标记6-FAM,初步建立RT-RAA方法。将鼠源抗6-FAM单克隆抗体作为金标抗体，链霉亲和素包被于检测线，羊抗鼠IgG包被于质控线，组装试纸条。将RAA技术与制备的胶体金试纸条相结合，建立起检测牛肠道病毒的RT-RAA-LFD方法，并对该方法的特异性、敏感性与重复性及临床应用等方面进行了评价。结果显示，该方法最佳引物浓度为5μmol/L,在35℃反应8 min即可完成对BEV核酸的扩增；该方法最低检测限为10～1拷贝/μL,且与牛病毒性腹泻病毒、牛细小病毒、口蹄疫病毒均无交叉反应；制备的试纸条于4℃条件下，有效期至少为90 d; 74份临床样品检测结果显示，该方法与RT-PCR检测结果一致。上述结果表明，本研究建立的BEV RT-RAA-LFD方法灵敏度高、特异性强，且操作更加便捷，适用于临床现场检测，为BEV感染的诊断和流行病学调查提供了新的技术手段。

登革病毒(dengue virus, DENV)引发的疾病严重威胁着人类的生命健康，我国尚无对应的有效疫苗，本研究拟制备出1种针对Ⅱ型DENV的重组亚单位候选疫苗。以Ⅱ型DENV EDⅢ基因为目的基因，构建重组真核表达质粒并转染至悬浮细胞中表达目的蛋白，筛选合适的免疫剂量来免疫小鼠，进行免疫原性分析。成功构建出DENV重组真核表达载体，转染至HEK-293F表达目的蛋白，大小约为15 kDa。以铝盐为佐剂与不同剂量的重组蛋白混合免疫小鼠，分析免疫原性，首次免疫后第35天时，3个蛋白免疫组小鼠血清中特异性抗体水平明显高于佐剂组和PBS组，10μg D2EDⅢ蛋白组和20μg D2EDⅢ蛋白组特异性抗体水平分别是5μg D2EDⅢ蛋白组的1.43和1.56倍，抗体分型偏向于IgG1,表明本研究制备的Ⅱ型DENV重组亚单位候选疫苗主要提高体液免疫应答，但3个蛋白免疫组之间IgG1抗体水平差异并不显著。综合免疫效果及疫苗成本，每只小鼠最佳目的蛋白免疫剂量确定为10μg。本研究制备了1种Ⅱ型DENV重组亚单位候选疫苗，为DENV的预防提供参考。

应用F81细胞从临床症状表现为口腔黏膜溃疡、鼻腔黏膜潮红且分泌物增多的患病猫中分离出1株病毒，通过PCR鉴定测序、形态学、血清学和动物回归试验分析确定该病毒为猫杯状病毒，命名为FCV-BJ。同时，制备该病毒灭活疫苗，并对其安全性与有效性进行了确定。结果显示，该分离毒株FCV-BJ血清学和形态学符合杯状病毒特点，动物回归试验表明该毒株有较强毒力，感染猫呈现猫杯状病毒感染的临床症状。将不同滴度的第5代病毒细胞培养物以β-丙内酯作为灭活剂灭活后免疫家猫，并在加强免疫21 d后攻毒。攻毒14 d后以10^7.0TCID₅₀/mL及以上滴度免疫的家猫组未发病，而对照组猫全部发病。上述结果表明，FCV-BJ分离株灭活疫苗免疫原性较好，最小免疫剂量在10^7.0 TCID₅₀/mL并且具有较强的保护效力，可作为疫苗生产用候选毒株，为将来猫杯状病毒疫苗的研制提供新毒株参考和奠定基础。

旨在探讨犊牛脑炎大肠杆菌对小鼠脑微血管内皮细胞(BMEC细胞)和小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S细胞)以及健康小鼠肺脏、脑组织的炎性损伤机制。研究采用致病性大肠杆菌菌株侵染BMEC细胞和MH-S细胞，观察细胞形态变化；平板计数法检测菌株对细胞的黏附、侵袭能力以及小鼠肺脏、脑组织载菌量；RT-qPCR检测菌株对细胞及小鼠脏器不同时间段的TNF-α、IL-1β、IL-6基因表达量的影响；Western blot检测感染后细胞及小鼠脏器与炎症有关信号通路重要蛋白p-NF-κB、p-JAK2、p-STAT3表达量。结果显示，侵染组细胞培养基浑浊，细胞视野变暗、模糊不清，部分细胞皱缩死亡，产生较多细胞碎片。菌株对BMEC细胞的黏附率和侵袭率3 h显著低于6 h(P<0.050),对MH-S细胞的黏附率和侵袭率在3 h显著高于6 h(P<0.010);感染小鼠脑组织大面积水肿、出血，肺脏有不同程度的肿大和出血，脑、肺脏组织载菌量在12 h最高。与对照组相比，感染组在3和6 h的IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达量均显著上升(P<0.050),且BMEC细胞和MH-S细胞的炎性因子mRNA表达量分别在6、3 h最高；感染小鼠脑、肺脏组织的炎性因子mRNA表达量随时间延长呈现先增加后减少的趋势，均在感染12 h有最高的表达量；侵染组的BMEC细胞和MH-S细胞及小鼠肺脏、脑组织的p-NF-κB蛋白表达量显著高于对照组(P<0.001),p-JAK2蛋白和p-STAT3蛋白表达量显著低于对照组(P<0.050)。上述结果表明，致病性大肠杆菌可黏附侵袭BMEC细胞和MH-S细胞，促进细胞及组织NF-κB蛋白表达、抑制JAK2蛋白和STAT3蛋白表达，进而刺激细胞及组织产生炎性反应。

蓝舌病病毒(bluetongue virus, BTV)是一种严重危害绵羊等反刍动物的一种虫媒病毒，为研究蓝舌病病毒感染与宿主细胞干扰素抗病毒免疫应答的分子机制。研究以感染复数(MOI)为1的BTV诱导18、24、36 h的BHK-21细胞通过实时荧光定量PCR分析干扰素通路基因mRNA表达特征，以及Western blot分析MDA5、TRAF3、RIG-Ⅰ和TBK1蛋白表达。结果表明，在诱导24 h时，干扰素信号通路基因表达的变化最为明显，IFN-α、IFN-β、RIG-Ⅰ、TBK1、MDA5、VISA、TRAF3基因的mRNA表达水平呈上调表达，而IKKε、TRAF6基因的mRNA表达水平呈下调表达，在蛋白水平上MDA5、TBK1蛋白上调表达而RIG-Ⅰ、TRAF3蛋白下调表达，表明BTV感染诱导BHK-21细胞中Ⅰ型干扰素免疫应答，为进一步探究IFN-Ⅰ信号通路调控基因在BTV感染的宿主细胞抗病毒免疫机制研究奠定基础。

猪关节炎作为规模化猪场常见的慢性疾病之一，会导致肉猪生产性能降低，对猪场的正常生产具有较大影响。本试验从1头跛行的猪关节液内分离纯化得到1株副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS),对分离菌株进行血清型、毒力基因和耐药性等病原学方面的研究，结合敏感药物对临床关节炎肉猪展开治疗，为将来实际生产中肉猪关节病的综合防治提供理论依据。本试验从病猪关节液里分离得到1株14型强毒株HPS,HPS分离株对β-内酰胺类药物和四环素类药物敏感，氟苯尼考与多黏菌素在较低的药物浓度时也能完全抑制HPS分离株的生长，但细菌对新诺明和环丙沙星出现耐药性。使用盐酸多西环素注射液和恩诺沙星注射液对临床关节炎的病猪进行治疗，治疗效果良好。相较于感染组病猪腕关节、跗关节难以屈曲，明显跛行的状态，治疗组病猪明显好转，可正常行走，关节仅轻微肿胀，关节病临床症状得到缓解。

表位疫苗是近年来快速发展的一种新型疫苗构建策略，具有安全性高、可诱导机体产生高效的特异性体液免疫和细胞免疫应答等优势。其中，抗原表位的鉴定和递送是设计表位疫苗的关键。相比传统的抗原表位鉴定方法，目前已发展了生物信息学、ELIspot以及细胞内细胞因子染色等多种新技术。由于用表位抗原肽直接免疫的效果通常不理想，因此为了使表位诱导良好的免疫应答，亟需有效的递送系统。目前，常用的抗原表位递送系统主要包括病毒载体和自组装纳米颗粒等非病毒载体两种。另外，为增强表位的免疫效果，常对抗原表位进行修饰，如多个抗原表位串联及靶向修饰等方法。本综述总结了精确鉴定具有良好免疫原性抗原表位的方法以及抗原表位的有效递送策略，以期为新型表位疫苗创制提供一定的理论指导。

根据GenBank上已公布的鸭源多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）kmt1基因序列，设计PCR扩增引物，将扩增所得kmt1基因克隆至pMD19-T载体中，构建重组质粒标准品pMD19-T-kmt1,并经PCR和测序鉴定。以pMD19-T-kmt1质粒为模板，kmt1基因为靶基因，设计并合成重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）引物；根据横向流动试纸条（lateral flow dipstick, LFD）要求设计1条探针（Pm-P）,经反应条件优化，建立了检测Pm的RPA-LFD方法，并进行特异性、灵敏性试验，用所建方法对64份临床样品进行检测。结果显示：建立的Pm RPA-LFD方法在37℃15 min即可完成扩增反应；提取鸭源大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）、鸭源沙门菌（Salmonella enteriditis,SE）、鸭疫里默杆菌（Riemerella anatipestifer,RA）、葡萄球菌（Staphylococcus）、鹅细小病毒（goose parvovirus, GPV）、鸭瘟病毒（duck plague virus, DPV）、番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus, MDPV）的DNA作为模板，以质粒标准品pMD19-T-kmt1为阳性对照进行RPA-LFD,显示除阳性对照外其他均为阴性；将质粒标准品pMD19-T-kmt1进行10倍倍比稀释，以浓度为10～7～10⁰ 拷贝/μL的质粒标准品为模板，检测出敏感度为1.50×10～1拷贝/μL,比PCR方法高100倍。利用PCR、RPA和LAMP-LFD检测64份疑似RA临床样本，3者检出符合率为100%。结果表明，本试验建立的Pm RPA-LFD方法具有特异性强、检测速度快、敏感度高等特点，可应用于Pm的临床样本检测。

用生物信息学软件将本实验室分离的Escherichia coli QML2206-1(E.coli QML2206-1)株与不同菌种的外膜蛋白A(OmpA)蛋白氨基酸序列进行同源性分析，并对OmpA蛋白进行理化性质分析、跨膜结构和信号肽预测、B细胞抗原表位预测、二级和三级结构预测；将OmpA基因片段与pET-32a载体连接，构建原核表达载体，在BL21(DE3)进行原核表达并优化表达条件后用镍柱亲和纯化系统进行纯化；将纯化后的重组蛋白与弗氏佐剂充分混匀后免疫小鼠，利用ELISA方法检测小鼠特异性IgG抗体水平及小鼠血清中细胞因子CD4、CD8、IL-4的表达水平，并通过小鼠攻毒保护试验评价其免疫保护效果。结果显示，OmpA蛋白为亲水性蛋白，无跨膜结构域，二级结构主要由无规则卷曲(47.98%)和α-螺旋(29.77%)构成，有12个能与B细胞产生的抗体结合的抗原表位。经原核表达成功获得相对分子质量约为55 kDa的重组蛋白OmpA,且在37℃、IPTG浓度0.000 4 mol/L诱导6 h的表达量最高。重组蛋白免疫小鼠后血清特异性IgG抗体效价最高可达1∶32 000;与对照组相比，免疫小鼠血清中CD4、CD8及IL-4的表达水平均有升高。用最小致死量(minimum lethal dose, MLD)、2倍最小致死量(2MLD)攻毒后小鼠存活率分别为80%、40%。结果表明，OmpA重组蛋白具有良好的抗原性和一定的免疫保护作用。该研究为下一步基于OmpA蛋白的牦牛适用性E.coli基因工程亚单位疫苗的研制提供了技术依据。

为了评估弓形虫tR NA硫化修饰酶TgMnmA基因缺失虫株对ICR小鼠的免疫原性和免疫保护效果,本研究构建了RHΔMnmA免疫的小鼠模型,通过腹腔注射10个RHΔMnmA速殖子对小鼠进行免疫,30 d后利用间接ELISA技术检测免疫后小鼠的特异性IgG抗体及其亚型,制备脾淋巴细胞悬液,利用流式细胞术分析脾淋巴细胞亚群,并通过实时荧光定量PCR技术检测各细胞因子mRNA的相对表达水平;对免疫30 d后的小鼠腹腔接种RHΔku80速殖子,5 d后检测小鼠腹水、心脏、肝脏和脑的荷虫量,观察并记录小鼠感染后30 d内的存活情况。结果表明,与对照PBS组相比,RHΔMnmA免疫组产生了更高的IgG和IgG2a抗体水平,细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和IFN-γ的mRNA相对表达水平都有不同程度的上升,小鼠脾淋巴细胞CD4⁺和CD8a⁺的数量也显著增加;同时,对于RHΔku80虫株的攻击,免疫组能够有效降低小鼠腹水和部分脏器的荷虫量,抑制虫体的体内繁殖,并显著提高小鼠的生存率。本研究结果显示,弓形虫TgMnmA基因缺失虫株能够诱导小鼠产生较强的体液和细胞免疫应答,并且针对RHΔku80虫株的感染提供良好的免疫保护,有成为候选抗弓形虫减毒活疫苗的潜力。

围产期奶牛血糖降低会影响外周血中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)能量的供应和免疫功能的发挥。成纤维细胞生长因子21 (fibroblast growth factor 21,FGF21)是一种重要的糖代谢调节剂,一些围产期奶牛血清FGF21水平在分娩后显著升高。为探究FGF21对围产期奶牛PMN葡萄糖稳态的作用,将产后3周内的奶牛分为高FGF21组(high FGF21,n=8,FGF21> 800 ng/L)和低FGF21组(low FGF21,n=8,FGF21 <200 ng/L),分离外周血PMN后通过流式细胞术、qRT-PCR和Western blot等方法检测葡萄糖摄取和代谢相关指标。结果显示,与低FGF21组相比,高FGF21组PMN的葡萄糖摄取以及葡萄糖转运蛋白SLC2A1、SLC2A3的mRNA表达显著升高。高FGF21组PMN中磷酸果糖激酶1(PFK1)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的活力显著升高,糖原合成酶(GCS)的活力显著降低。高FGF21组PMN的乳酸含量和ATP含量显著升高,己糖激酶(HK2)、PFK1的mRNA和蛋白表达显著升高。结果表明,围产期外周血FGF21升高的奶牛PMN对葡萄糖的摄取、利用升高,保障了PMN的ATP供应,为缓解围产期奶牛免疫抑制新策略的提出提供了理论基础。

为探究枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides,LBP)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的蛋雏鸡炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)肠道损伤的保护作用。首先采用网络药理学方法获得枸杞子防治IBD的靶点蛋白信息,并对其进行蛋白互作关系分析、GO和KEGG富集分析及分子对接。然后进行动物试验:将100只1日龄雄性海兰褐蛋鸡随机分为5组,即空白对照组(CON)、LPS处理组(LPS)组、LBP低剂量组(LPS+LBP 0.25 g/L,L-LBP)、LBP中剂量组(LPS+LBP 0.5 g/L,M-LBP)和LBP高剂量组(LPS+LBP 1 g/L,H-LBP)。饲养至21日龄采集十二指肠、空肠、回肠、盲肠,测定肠组织中SOD和GSH-Px水平,实时荧光定量PCR对肠组织中TNF-α、AKT1、IL-6、IL-1β、TP53的mRNA表达进行检测。结果表明:网络药理学结果显示枸杞子活性成分共筛选到166个,其作用于TNF、AKT1、IL-6等116个关键蛋白靶点,主要富集AGE-RAGE、IL-17、TNF、HIF-1、NF-κB等信号通路。分子对接发现配体受体对接分数良好,并通过氢键、疏水作用力稳定结合。与LPS组相比,0.5 g/L LBP试验组SOD和GSH-Px水平显著升高。与LPS组相比,中、高剂量LBP试验组TNF-α、AKT1、IL-6、IL-1β mRNA表达显著降低,TP53 mRNA表达显著升高(P<0.01)。综上所述,枸杞子可通过多成分、多靶点、多通路机制预防雏鸡IBD。

新疆不同动物都携带大肠杆菌O157:H7(E.coli ()157:H7),但是这些菌株之间的联系不清楚。为了解E.coli O157:H7的进化分群、优势遗传谱系的分布、生物膜形成能力、携带可移动遗传元件情况及其耐药谱,对E.coli O157:H7用多重PCR法鉴定系统进化分群,通过多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)方案检测E.coli O157ST型,结晶紫微孔板法测定生物被膜形成能力(BF),Kirby-Bauer法检测耐药情况,PCR法检测耐药、质粒复制子、整合子基因。结果显示新疆46.7%(7/15)的E.coli O157:H7属于A群,53.3%(8/15)属于E群,羊源以A群流行为主(4/6),牛源以E群为主(6/7);共检测出6种ST型,分别为ST11(8/15)、ST-206(1/15)、ST-6126(3/15)、ST-1640(1/15)、ST-178(1/15)、ST-4550(1/15);有2株具有中等成膜能力,2株具有弱成膜能力,10株无成膜能力;均为多重耐药菌株,对林可霉素、苯唑西林、克林霉素、万古霉素、麦迪霉素和头孢噻吩完全耐药,多黏菌素B、氨苄西林、青霉素G、红霉素耐药率为88%～94%,具有高度耐药性;检测到5种耐药基因,分别是acrA(66.66%,10/15)、tolC (73.33%,11/15)、qurS (13.33%,2/15)、floR qurA (6.67%,1/15);4种质粒复制子,分别是IncP(66.66%,10/15)、IncFrepB (86.67%,13/15)、IncFIA (6.67%,1/15)、IncFIB (66.66%,10/15);2种Ⅰ类整合子,分别是ISCR1 (33.33%,5/15)、ISECP1(20%,3/15)。结果显示,新疆地区的E.coli O157:H7以A群和E群流行为主,羊源以A群流行为主,牛源以E群为主,ST型分布较广,其中以ST11型为主,生物膜成膜能力较弱,耐药性强,均为多重耐药菌株,耐药基因以外排泵为主,耐药基因传播元件较多。

从我国吉林地区患有肺炎的病猪分离到优势菌株，对分离菌株进行16S rRNA鉴定，确定为副猪链球菌(Streptococcus parasuis,S.parasuis),命名为WYF-8B。药敏纸片扩散法检测结果显示，WYF-8B对杆菌肽、磺胺间甲氧苄啶、林可霉素、红霉素、磷霉素、阿奇霉素、青霉素、多西环素、复方新诺明、磺胺异恶唑、环丙沙星、恩诺沙星、四环素、苯唑西林、庆大霉素、头孢唑林、氨苄西林均耐药；对氟苯尼考，氯霉素高度敏感。生化鉴定结果显示，WYF-8B可发酵水杨酸、麦芽糖、乳糖、蔗糖、七叶苷、葡萄糖；不发酵甘露醇、尿素、棉子糖、木糖、阿拉伯糖、山梨醇。利用第二代全基因组测序技术对WYF-8B耐药基因型进行研究，结果发现其携带对大环内酯类抗生素的抗性基因Mef(E)、ErmB,对β-内酰胺类抗生素的抗性基因pbp2b、pbp1a、pbp2x,对氟喹诺酮类抗生素的抗性基因gyrA、parC、grlB,对氨基糖苷类抗生素的抗性基因ANT(6)-Ia、AAC(6')-Ie-APH(2'')-Ia、ANT(9)-Ia、APH(3')-Ⅲa,对林可酰胺类抗生素的抗性基lnuB、lmrC、lmrD,对四环素类抗生素的抗性基因tetM,对杆菌肽的抗性基因bcrA,结果显示耐药表型与测序结果的耐药基因型相符。WYF-8B毒力因子研究结果显示，WYF-8B共携带13个毒力因子(pavA、fbp54、clpP、cps4I、wbtB、cpsI、tufA、galE、hasC、groEL、wbtL、gndA、wbtF),其作用机制主要为促进细菌的扩散、转移、定居、抗吞噬及不被宿主免疫细胞识别等。药物敏感试验结果为研究副猪链球菌的临床用药提供参考，耐药表型与毒力因子为新型药物及疫苗的研发奠定基础。

对NCBI文库公布的120条不同亚型禽流感病毒的M基因序列进行分析，筛选得到一处高保守片段并进行重组酶介导等温核酸扩增(recombinase-aided amplification, RAA)引物和crRNA的设计。待测样品先进行RAA核酸扩增，再将扩增产物转移至有规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/Cas13a检测体系中，通过监测该体系中荧光值的变化情况进行结果判定。使用梯度稀释(10～6～10～0拷贝/μL)的标准阳性质粒以及其他7种禽病病毒验证方法的灵敏度和特异性，并利用本试验所建方法和国标荧光RT-PCR方法对50份临床样品(21份阳性样品、29份阴性样品)进行检测以评价方法的检测性能。结果显示，本试验建立的检测方法灵敏度为10～2拷贝/μL,较普通RAA方法灵敏度提高了2个数量级；能特异性检出AIV,不与NDV、IBV、ILTV、IBDV、ALV、AMPV、AAV-1发生交叉反应；与国标荧光RT-PCR方法相比，该方法检测的特异性、准确性和一致性分别为100%、95.24%和98.00%。结果表明，本试验建立了检测AIV通用型的RAA-CRISPR/Cas13a快速诊断技术，其在37℃条件下60 min内即可完成检测，具有快速、灵敏、特异等优势，为AIV的现场快速检测提供了手段。

鸡球虫专门在鸡肠道黏膜上皮细胞内生长繁殖，危害鸡群健康。然而，传统的化学药物很难通过细胞屏障，并且易造成耐药虫株的出现以及兽药残留问题，给球虫病的防控带来巨大的挑战，因此，有必要开发新的抗球虫策略。纳米药物具有生物相容性好、易修饰且效率高等优势，提高细胞膜的穿透性的同时降低了药物的毒副作用，有望应用于球虫病防治。本文介绍了多种抗鸡球虫病的纳米药物，总结了其与传统制剂相比的优点，重点介绍纳米药物在治疗鸡球虫病中的应用，阐述目前纳米药物治疗鸡球虫病仍存在的问题，并对该领域面临的挑战和未来发展方向进行展望，以期为开发用于治疗鸡球虫病的纳米药物提供重要参考。

为了分析黏菌素体外诱导肠炎沙门菌耐药的主要耐药机制。本研究针对肠炎沙门菌CMCC(B)50335(ZK),通过体外诱导其对黏菌素耐药，并采用比浊法、半固体琼脂法、透射电镜、纸片扩散法测定诱导前后生长特性、运动能力、超微结构及对16种抗菌药物敏感性变化，Illumina NovaSeq PE150法检测其全基因组及单核苷酸多态性(SNP),RT-qPCR检测6种耐药相关基因表达量差异，Red大肠杆菌同源重组法构建诱导耐药株E1-128-1的phoP基因重组株△phoPE1-128-1,并检测对黏菌素的敏感性变化。结果表明，筛选出3株诱导耐药菌E1-128-1、E1-128-3、E2-128-3,耐药稳定性检测后最小抑菌浓度(minimal inhibit concentration, MIC)分别升高128、64、64倍；诱导耐药对受试菌生长能力及16种抗菌药物敏感性无显著性影响，E1-128-1运动能力显著升高，细胞壁及质膜明显增厚；诱导前后E1-128-1基因组组分无明显差异，但检测出phoP/phoQ、cpxP、lptD、csrA、acrB等6个耐药相关基因的8个错义突变，包括phoP错义突变位点4个，分别为Leu185Trp、His189Ser、Thr190Tyr和Ile191His,对相应基因进行PCR测序，结果与SNP结果相符；RT-qPCR结果表明3株诱导菌突变基因表达量均显著性上升；△phoPE1-128-1的黏菌素MIC值较E1-128-1下降至1 mg/L。提示phoP基因突变及表达量升高是体外诱导沙门菌CMCC(B)50335多黏菌素耐药的重要因素。

非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是一种猪的急性、热性、高度接触传染性出血性传染病，具有高度致死性，给养猪业造成巨大经济损失。ASF的实验室确诊目前多采用特异性核酸扩增技术，但该方法受多种因素影响，尤其是环境中核酸扩增产物的污染给扩增结果判定带来诸多困扰。为了对ASF临床样品进行高通量诊断检测，本研究以ASF阳性猪血清IgG为捕获抗体，HRP标记的p72单克隆抗体为检测抗体，以细胞培养的非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）绘制标准曲线，建立了双抗体夹心ELISA抗原检测方法，并评价了其敏感性、特异性和重复性，进一步比较了不同因素对抗原检测的影响。结果显示，本研究建立的夹心ELISA检测方法对重组蛋白和ASFV的最低检测限分别为0.1 mg/L和10^3.7 TCID₅₀/mL,与5种常见致病性猪源性病毒均不发生交叉反应，试验批间变异系数小于10%;与实时荧光定量PCR对临床血液病毒检测的总符合率为92%（23/25）。在对灭活ASFV抗原的检测中证明，BEI灭活会显著降低ASFV抗原检测的灵敏度，铝胶佐剂和纳米佐剂会干扰抗原的检出。综上，本研究建立的双抗体夹心ELISA抗原检测方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性，与qPCR法有良好的一致性，为ASFV临床诊断以及灭活ASFV抗原评价提供了一种高通量检测方法。