为探究兰州百合（Lilium davidii var. unicolor）响应自毒胁迫的代谢机制，以1年生（Lily1）、2年生（Lily2）和3年生（Lily3）兰州百合为研究对象，采用气相色谱-质谱（GC-MS）技术分析了不同连作年限兰州百合的代谢组学变化，在其提取物中共检测和鉴定出124种代谢物。利用R软件对样品进行归一化，通过正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）寻找差异代谢物，并筛选相关代谢物途径进行联合分析。结果表明：Lily1与Lily2的代谢组间存在明显差异，共有16种呈上调的差异代谢物（脂质类、黄酮类、糖类及酚类），且均上调；显著富集至酪氨酸代谢、丙酸代谢和类黄酮生物合成代谢通路。其中脂质类、黄酮类和糖类物质含量的提升表明在兰州百合连作的第2年，自身通过积极合成脂质类、黄酮类和糖类物质来响应自毒胁迫。Lily1与Lily3的代谢组间共有21种差异代谢物，包括1种上调代谢物（3-α-甘露二糖）和20种下调代谢物（胺类、酸类和脂质类）；显著富集至5条代谢通路，分别为托烷、哌啶和吡啶生物碱的生物合成、磷酸盐和次磷酸盐的代谢、赖氨酸降解、谷胱甘肽代谢和D-氨基酸代谢。Lily2与Lily3组间同样有21种差异代谢物，唯一上调代谢物也为3-α-甘露二糖。这表明，在兰州百合连作的第3年，糖类物质作为直接参与维持细胞膜稳定性的碳水化合物，积极响应自毒胁迫。20种下调代谢物分别为胺类、酸类和脂质类，仅显著富集至丙酸代谢和类黄酮生物合成代谢通路。