腺苷酸激酶(adenylate kinase, ADK)可逆催化2分子腺苷二磷酸(adenosine diphosphate, ADP)转化为腺苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)和腺苷一磷酸(adenosine monophosphate, AMP),实现ATP再生。由于游离酶的反应温度和pH适应范围窄、稳定性差且无法重复使用,导致游离酶的使用成本较高,这阻碍了其在工业规模生产中的应用。为了实现ADK的固定化,本研究首先构建了ADK的表达质粒pET-ADK,并经大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达获得重组ADK;然后优化了壳聚糖的质量浓度以及固定化过程中酶液的pH、酶的质量浓度和固定化时间,并检测了3D打印固定化ADK的理化性质及ATP再生能力。结果表明:基于壳聚糖墨水3D打印固定化酶的最优条件是——壳聚糖的质量浓度为3%,酶液的pH为7.5,酶的质量浓度为0.10mg/m L,固定化时间为3 h;利用3D打印固定化的ADK,葡萄糖激酶催化葡萄糖生成D-葡萄糖-6-磷酸的产率提高了52.00%,而且重复使用8次后, 3D打印固定化的ADK仍能保留初次活性的74.83%。上述结果为可用于ATP再生的ADK固定化研究提供了重要参考。