绿色木霉碱性蛋白酶基因TvALP的克隆与原核表达

徐杨玉, 刘付香, 洪彦彬, 陈小平, 李海芬, 温世杰, 李杏瑜, 李玲, 梁炫强

热带生物学报 ›› 2024, Vol. 15 ›› Issue (06) : 683-690. DOI: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20240077

绿色木霉碱性蛋白酶基因TvALP的克隆与原核表达

  • 徐杨玉, 刘付香, 洪彦彬, 陈小平, 李海芬, 温世杰, 李杏瑜, 李玲, 梁炫强
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摘要

基于绿色木霉中抗菌蛋白质的de-novo质谱测定得到的部分肽段序列,通过BLASTp数据库检索,发现该肽段由碱性蛋白酶基因编码,采取同源克隆技术扩增出目的基因片段。生物信息学分析揭示,TvALP基因(GenBank编号KJ659907)完整开放读码框为1 230 bp,并编码了一个由409个氨基酸组成的蛋白质。该蛋白质的预测分子量约为43 kD,且含有一段由20个氨基酸组成的信号肽。根据分类,该蛋白质属于Peptidase inhibitor_I9超家族,并且是枯草杆菌蛋白酶家族丝氨酸蛋白酶S8家族的一个成员。利用双酶切法将测序正确的质粒连接至原核表达载体pET30a中,在宿主菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达。结果在45 kD处显示出1条特异蛋白质条带,与生物性信息预测目的蛋白大小一致,表明切除信号肽的表达质粒pET30a-ΔTvALP(“Δ”表示切除信号肽)在宿主菌BL21(DE3)pLysS中成功表达。经超声波破碎后,蛋白形成了包涵体。但经体外复性技术,未能获得有活性的蛋白进行抗菌机理研究。

关键词

绿色木霉 / 碱性蛋白酶基因 / 原核表达 / 包涵体

中图分类号

S476

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徐杨玉, 刘付香, 洪彦彬, 陈小平, 李海芬, 温世杰, 李杏瑜, 李玲, 梁炫强. 绿色木霉碱性蛋白酶基因TvALP的克隆与原核表达. 热带生物学报. 2024, 15(06): 683-690 https://doi.org/10.15886/j.cnki.rdswxb.20240077

基金

2023年国家花生产业技术体系遗传改良研究室岗位科学家项目(CARS-13); 广东省自然科学基金重点项目(07117967)

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