棉花黄萎病是棉花上的重要病害，严重威胁棉花产业。中国棉花黄萎病病原为大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）。棉花黄萎病防治困难，建立快速准确的分子检测方法对于该病的早期诊断、预警和防治具有重要意义。通过NCBI BLAST进行序列比对，找到大丽轮枝菌种内具有高度种间特异性和种内保守性的物种特异性序列，根据序列设计6对引物，筛选出特异性强、灵敏度高可用于检测大丽轮枝菌的巢氏PCR引物，并摸索最佳扩增条件。筛选到了两组巢氏PCR引物分别是VD-2和VD-5，扩增条件为：95℃5 min;95℃30 s;58℃30 s;72℃1 min,35个循环；72℃10 min，条带大小分别为512和375 bp。该方法可检测到的病菌DNA下限为1×10-6 ng·μL-1，比常规PCR灵敏度提高了3个数量级，使用包括长孢轮枝菌在内的15种菌对引物特异性进行了验证，检测混有大丽轮枝菌孢子的棉籽发现该方法的检测下限是每颗棉籽可达10个孢子。