冰草是小麦抗逆遗传改良的重要近缘植物，开发冰草基因组分子标记对于加快冰草的遗传育种效率和利用具有重要意义。本研究基于转录组测序（RNA-seq）技术，对2个冰草材料的幼嫩根、茎、叶片及结实期的花穗、种子进行生物信息学分析，开发高多态性的EST-SSR标记并进行验证。结果表明，共获得23 491 793条高质量序列，其碱其长7.03 Gb, GC含量56.44%,Q30为93.04%。共获得33 993条Unigene,总长度为29 309 958 bp。将所获Unigene与9大功能数据库进行比对，共有25 614条Unigene获得功能注释，其中Nr数据库共注释24 557条，GO数据库注释到66 193条Unigene,按功能分为3个大类和42个亚类；共14 412条Unigene注释到KEGG数据库的136条代谢通路；有11 321条Unigene在KOG数据库获得注释，归属为25个功能类别；共预测到大于100 bp的CDS有7 288条，SSR位点2 443个，其中三碱基重复1 439个，占总数的58.90%;获得EST-SSR多态性引物42对，从中随机选择10对在冰草的30个F₂代分离单株进行有效性验证，平均多态性比率为48.33%。以上结果说明利用RNA-seq技术大量开发的EST-SSR引物，可高效地应用于四倍体冰草产量、品质性状相关的标记开发、优异新种质指纹图谱构建及精准分子标记辅助育种。