L–异亮氨酸作为必需氨基酸具有重要的生理功能，被广泛应用于食品、医药、农业等领域。针对目前发酵工业中L–异亮氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）存在营养缺陷、发酵周期长等不足，利用代谢工程策略从头构建L–异亮氨酸合成菌株。首先，过表达解除反馈抑制的天冬氨酸激酶、苏氨酸脱水酶以及乙酰乳酸合酶编码基因lys C^A279T、ilvA（G418A/T1147G）和ilvBN^A139T/T140A以强化L–异亮氨酸合成通路，所获菌株ILE-3的L–异亮氨酸产量达到3.5 g/L。然后，过表达丙酮酸羧化酶编码基因pyc以增强前体物L–天冬氨酸的供应。在此基础上过表达L–异亮氨酸输出蛋白编码基因brnFE以促进其外排，获得菌株ILE-6。该菌株在5 L发酵罐经发酵48 h后，ILE-6的L–异亮氨酸产量和转化率分别达到21.3 g/L和14.1%。该菌株遗传背景清晰、无营养缺陷、发酵周期短，其所用策略可为分支链氨基酸生产菌株的代谢工程构建提供参考。