利用偶发分枝杆菌(Mycobacteriumfortuitum)MFT降解植物甾醇生产9α-羟基-雄烯二酮(9α-OH-AD)过程中，存在丙酰辅酶A过量积累及辅因子不平衡等问题，影响菌株的转化效率。通过表达scpC降低胞内丙酰辅酶A含量，并通过串联表达ndh解决植物甾醇侧链降解过程中胞内辅因子I不平衡的问题，在此基础上表达AarC将琥珀酰辅酶A和乙酸盐转化为琥珀酸盐和乙酰辅酶A，增强三羟酸(TCA)循环。构建的重组工程菌株MFT-scp C-Aar C-ndh经初步优化发酵后，9α-OH-AD产率达到89.56%，比原始菌株转化率提高了37.86%。本研究为9α-OH-AD的工业化生产提供了理论基础和技术支持，也为其他植物甾醇转化工程菌株的构建提供新策略。